Исследования по мониторингу резистентности ВИЧ перед началом АРВ терапии

Этот вид исследования представляет собой упрощенный подход к проведению                             второго компонента исследования по мониторингу приобретенной резистентностиВИЧ         к АРВ препаратам среди пациентов, получающих АРТ первой линии. Это информация может быть собрана при проведении когортных исследований, а в некоторых странах стандартным подходом является проведение анализа на резистентность ВИЧ для всех ВИЧ-инфицированных перед началом АРТ. Наименее затратным и более соответствующим текущим потребностям в Российской Федерации является альтернативный вариант – проведение кросс-секционного выборочного исследования среди пациентов, впервые   начинающих АРТ.

Цель: оценка эффективности программы лечения ВИЧ-инфекции на популяционном уровне и оценка распространенности резистентности у пациентов до начала АРТ           первой линии.

Задачи: Определить долю пациентов, имеющих резистентность перед началом АРТ первой линии. Определить структуру выявленных мутаций резистентности ВИЧ. Дополнительной задачей является определение распространенности различных типов и субтипов ВИЧ среди инфицированных ВИЧ, получающих терапию.

Целевая группа: пациенты, нуждающиеся в АРТ и впервые начавшие получать АРТ терапию первого ряда, в том числе дети в возрасте менее 18 месяцев. Не имеет значения получали ли пациент ранее АРВ препараты с целью химиопрофилактики.

Дизайн исследования: кросс-секционное выборочное исследование с определением вирусной нагрузки, резистентности и субтипов ВИЧ до начала лечения.

Объекты проведения исследования: дозорными участками являются территориальные центры по профилактике и борьбе со СПИД, осуществляющие лечение АРВП не менее 500 пациентов с ВИЧ-инфекцией.

Диагностическая проба: 0.5 - 1 мл плазмы крови, забранной специально для исследования или для другой клинической цели, например определения CD4 и вирусной нагрузки. Каждый образец должен сопровождаться направлением на определение лекарственной резистентности ВИЧ (Приложение 3) и информированным согласием на участие в исследовании (Приложение 2).

Количество тестов: в рамках данного исследования: размер выборки определяется с учетом количества получающих АРТ в регионе (минимально 30-70 человек по одному ЛПО и всего 300-500 пациентов в стране). Для пациентов определяется: CD4, вирусная нагрузка и резистентность, субтип ВИЧ до начала лечения.

5. Общие принципы методов для определения лекарственной устойчивости ВИЧ                       на основе секвенирования

В настоящее время при исследовании на лекарственную устойчивость ВИЧ анализируются следующие гены: ген протеазы, ген обратной транскриптазы, ген интегразы и ген белка gp120, так как именно они являются основными генами – мишенями для действия основных схем антиретровирусной терапии.

Стандартная методика для выявления резистентности ВИЧ к АРВП на основе генотипирования включает следующие стадии:

· Приготовление проб – выделение РНК;

· Обратная транскрипция;

· Полимеразная цепная реакция (ПЦР);

· Автоматическое детектирование нуклеотидной последовательности (реакция секвенирования);

· Анализ с помощью программного обеспечения (получение консенсусной последовательности);

· Интерпретация полученных результатов (виртуальное фенотипирование).

Для проведения исследования по определению устойчивости ВИЧ к АРВ препаратам используется плазма крови. Для исследования требуется не менее 0,5-1 мл плазмы.

Суть реакции секвенирования сводится к проведению реакции амплификации, в состав реакционной смеси которой введены в небольшом количестве терминирующие дидезоксинуклеотидтрифосфаты ddNTP (проводится 4 реакции, каждая с определенным типом ddNTP или одна реакция, в которую вводится 4 типа ddNTP, но каждый тип имеет свою флуоресцентную метку). В ходе реакции ddNTP случайным образом обрывают синтез цепи, при этом остановка осуществляется ddNTP того типа, который комплементарен последней букве до обрыва. В результате такой реакции образуются фрагменты различной длины, последний нуклеотид в которой известен. Далее проводится электрофорез с разрешением в один нуклеотид. По последовательности фрагментов и исходя из знания терминального нуклеотида восстанавливается вся последовательность. В современном оборудовании определение последовательности проводится автоматически.

В соответствии с требованиями по точности во всех тест-системах на каждый анализируемый образец получается несколько электрофореграмм (от 4 до 8) с перекрывающимися последовательностями.

При помощи специального программного обеспечения осуществляется конструирование общей (консенсусной) нуклеотидной последовательности. В соответствии с требованиями ВОЗ полученный результат должен быть пересмотрен оператором.

При организации лаборатории следует учитывать, что проведение реакции секвенирования осуществляется в зоне учета результатов лаборатории, при этом последняя должна быть разделена на две подзоны:

· для проведения электрофореза;

· для проведения подготовительных этапов перед секвенированием (очистка ампликонов), постановки непосредственно реакции секвенирования и детекции результатов методом электрофореза высокого разрешения.