Тест на способность к продукции каталазы

Каталаза – это фермент, превращающий пероксид водорода (Н₂О₂) в воду и кислород. Химически каталаза является гемопротеином, сходным по структуре с гемоглобином, за исключением того, что содержит трехвалентное железо, а не двухвалентное.

Реагенты и материалы

А. 3% раствор перекиси водорода (хранить во флаконе из темного стекла в холодильнике)

Б. Суточная культура тестируемого микроорганизма.

Контроль качества: положительный контроль – агаровая культура Staphylococcus aureus (ATCC 25923), отрицательный контроль – агаровая культура Streptococcus pyogenes (ATCC 12344).

Методика

На предметном стекле суточная агаровая культура микроорганизма суспендируется в капле 3% раствора перекиси водорода. Пузырьки различной интенсивности появляются сразу или через 3–5 c.

Примечание

Не следует использовать для тестирования культуры старше 24 ч, так как фермент присутствует только в живых микроорганизмах, и может быть получен ложноотрицательный результат. Некоторые микроорганизмы имеют другие ферменты, разрушающие перекись водорода. Поэтому маленькие пузырьки в небольшом количестве, появляющиеся через 20–30 с, не рассматриваются как положительный тест.

Кроме того, каталаза присутствует в эритроцитах, поэтому может наблюдаться ложноположительный результат при заборе колоний со среды, содержащей кровь.

 

2.3. Идентификация H.influenzae с использованием X и V факторов

Потребность гемофил в Х и/или V факторах может быть определена при использовании полосок или дисков, импрегнированных Х, V и ХV факторами. При помещении на поверхность среды дисков с соответствующими факторами они легко диффундируют в питательную среду вокруг дисков. После инкубации потребность оценивается в зависимости от характера роста исследуемого микроорганизма вокруг дисков.

Материалы:

1) полоски или диски из фильтровальной бумаги, импрегнированные Х и V факторами (BBL, Oxoid);

2) питательная среда, не содержащая Х и V факторы (триптиказосоевый агар, сердечно-мозговой агар – brain-heart infusion agar);

3) питательный бульон (brain-heart infusion broth).

Контроль качества: Haemophilus parainfluenzae – требует V фактор, Haemophilus influenzae – требует Х и V факторы.

Методика

Приготовить легкую суспензию чистой суточной культуры исследуемого микроорганизма в питательном бульоне. Необходимо избегать переноса вместе с колониями геминсодержащей среды, что может привести к ложным результатам. С помощью стерильного тампона инокулировать поверхность питательной среды приготовленной суспензией. Поместить на поверхность агара диски или полоски, содержащие X, V и XV факторы, на расстояние 2 см друг от друга. Инкубировать 18–24 ч при температуре 35–37^оС в атмосфере с 5–10% СО₂.

Учет характера роста производится визуально. Наличие роста микроорганизма только вокруг дисков с Х и XV или V и XV факторами указывает на потребность соответственно в Х или V факторе. Рост только вокруг диска с XV факторами характерен для гемофил, нуждающихся в обоих факторах (например, H.influenzae).

 

2.4. Тест на определение O-нитрофенил- β -D-галактопиранозидазы (ONPG, β -галактозидазы)

Для демонстрации ферментации лактозы в обычных тестах требуется наличие двух ферментов. Пермеаза обеспечивает проникновение молекул лактозы в бактериальную клетку, а b-галактозидаза непосредственно гидролизует лактозу до галактозы и глюкозы.

У микроорганизмов, которые истинно не ферментируют лактозу, отсутствуют оба фермента. Однако некоторые бактерии могут не иметь пермеаз, но сохранять β-галактозидазу. ONPG (O-нитрофенил-β-D-галактопиранозидаза) – бесцветное вещество, сходное по структуре с лактозой. В присутствии β-галактозидазы ONPG разрушается на галактозу и О-нитрофенол, имеющий желтый цвет. H.influenzae в отличие от всех остальных видов рода не имеет β-галактозидазы.

Реактивы и материалы

В связи с большими техническими трудностями при изготовлении реактивов рекомендуется использовать готовые коммерческие диски, пропитанные ONPG (СИБ, Н.-Новгород; биоМерье, BBL, Oxoid, Difco).

Контроль качества: положительный контроль – агаровая культура Escherichia coli (ATCC 25922), отрицательный контроль – агаровая культура Proteus mirabilis (ATCC 29245).

Контроль качества следует проводить перед использованием каждого нового лота реактивов и перед тестированием каждого микроорганизма.

Методика

Приготовить густую суспензию исследуемого микроорганизма (эквивалентную стандарту мутности 2 по МакФарланду) в 0,5–1 мл 0,9% раствора хлорида натрия. Внести в пробирку таблетку или диск, содержащий ONPG, и инкубировать при температуре 35–37^оС. Предварительный учет реакции возможен через 1 ч.

Положительная реакция – появление желтого окрашивания в результате образования О-нитрофенола. Отрицательный результат может быть сообщен только после 24 ч инкубации.

 

Приложение 3

Определение мочевины

Используются 2 реактива.

Реактив А: стерильная дистиллированная вода – 4 мл, этиловый спирт 96% – 2 мл, мочевина – 2 г.

Реактив В: 0,2% раствор фенол-рот – 1 мл, KH₂PO₄ – 0,1 г, K₂HPO₄ – 0,1 г, NaCl – 0,5 г, дистиллированная вода – 100 мл.

Приготовление. Реактив А хранится при температуре 4–10^оС (не автоклавировать!). Реактив В стерилизуют при 1,5 атм. 30 мин. Перед употреблением ex tempore смешать 1 часть реактива А и 19 частей реактива В.