Описание процесса высаливания

Процесс высаливания ферментов в основном зависит от степени гидрофобности белковой молекулы. Типичная белковая молекула имеет гидрофобные участки на поверхности в виде боковых цепей ряда аминокислот (тирозин, триптофан,лейцин, изолейцин, метионин, валин и фенилаланин) На гидрофобных участках молекулы при соприкосновении с водой происходит образование слоя, состоящего из ориентированных молекул воды: эти участки оказываются блокированными (рисунок 2.1). Однако такое упорядочение структуры термодинамически неустойчиво, так как наблюдется снижение энтропии.

Рисунок 2.1 Схема расположения молекул воды на гидрофобных участках белка [2]

Если молекулы воды иммобилизовать молекулами небелковой природы, то происходит дегидратация неполярных участков белка, которые стремятся взаимодействовать друг с другом, образуют агрегаты, растворимость белка резко падает, и он выпадает в осадок. Чем выше концентрация соли, тем быстрее происходит образование осадка.

Различные белки по-разному реагируют на процесс высаливания. Это зависит в первую очередь от количества и размеров гидрофобных участков на поверхности белковой молекулы. Чем больше таких участков, тем легче идет высаливание белков. Есть белки, которые даже при очень высокой концентрации соли в растворе почти не агрегируют и не выпадают в осадок. При осаждении ферментов из сложной смеси разнообразных белков имеет место явление соосаждения. После дегидратации белковых молекул в растворе солей молекулы агрегируют не с идентичными, а с любыми другими «клейкими» молекулами, находящимися поблизости. Это приводит к получению препаратов, обогащенных различными сопутствующими балластными веществами. Однако при высаливании можно добиться не только осаждения всего комплекса ферментов, но и его фракционирования.

Факторы, влияющие на процесс

Хотя высаливание белков в основном определяется гидрофобными взаимодействиями, на этот процесс существенно влияют и другие факторы: рН среды, близость его к изоэлектрической точке белка, температура, степень чистоты ферментного раствора, длительность процесса и т.д.

Самую большую растворимость в солевых растворах большинство белков имеют при рН около 7, когда они содержат наибольшее количество заряженных групп, наименьшую растворимость – вблизи изоэлектрической точки. Поэтому целесообразно вести осаждение при рН вблии изоэлектрической точки.

Большое значение для растворимости белка имеет температура, так как она существенно влияет на гидрофобные взаимодействия. Обычно с повышением температуры растворимость белка падает и усиливается процесс агрегирования белковых молекул.

Какие соли используются

Для высаливания в основном используются нейтральные соли щелочных металлов. Высаливающий эффект различных ионов зависит от их ионной силы. По силе высаливающего действия анионы натриевых солей можно расположить в следующий ряд:

SO₄ ^2- > CH₃COO^- > Cl^-> NO₃^- > Br^- > I^- > CNS^-

а катионы —

Li ⁺> Na⁺> K⁺ >(NH₄)⁺

При высаливании сложных биохимических смесей соль может взаимодействовать и с другими соединениями, вызывая их осаждение. Поэтому высоленные или осажденные растворителями ферментные препараты содержат до 60-85 % балластных сопутствующих веществ.

Для высаливания могут быть использованы сульфат аммония, сульфат натрия, сульфат цинка и хлористый натрий. Наиболее часто используют сульфат аммония.

 По очистке и фракционированию с применением сульфата аммония выполнено огромное количеств работ, эта соль чрезвычайно эффективна в качестве осаждающего агента. Она  не только не оказывает денатурирующего действия на ферментные белки, но, наоборот, стабилизирует большинство из низ. Поэтому при ее использовании нет надобности вести фракционирование системы при низкой температуре.

Даже самые чистые препараты сульфата аммония имеют слабокислую реакцию и во всех случаях при использовании его необходим тщательный контроль рН при высаливаниях, вводят сухую соль или пользуются наиболее концентрированными, насыщенными растворами ее.

Обычно считают нецелесообразным повторять фракционирование сульфатом аммония в одинаковых условиях несколько раз подряд. Но если варьировать температуру или рН, то порядок, в котором будут осаждаться различные белки, может измениться. В таком случае целесообразно проводить фракционирование последовательно, при разных условиях. Иногда для разделения системы используют различные соли последовательно или в виде смеси. Так, известен метод, в котором обезжиренную муку земляного ореха экстрагировали 10%-ным хлористым натрием при рН = 6,0, а затем из осветленного экстракта белки фракционировали с помощью сульфата аммония.

Однако сульфат аммония при хранении проявляет тенденцию к закислению и даже к выделению аммиака; он очень агрессивен по отношению к металлам и бетону, и возникают большие сложности при нейтрализации и регенерации этой соли в промышленных масштабах.