Работа в культуральной лаборатории

Как правило, лаборатория, где проводят работы с культурами клеток, состоит минимум из 3-х помещений. Это бокс, где ведутся стерильные работы; комната для приготовления питательных сред, хранения химикатов, оборудования и т.д.; автоклавная.

Но в настоящее время современные модели автоклавов стали более надежными и безопасными в использовании, с ними могут работать и необученные специально люди, а отдельных комнат не требуется.

Подготовка бокса к работе

Различные манипуляции с культурами клеток проводят в специальном помещении - стерильном боксе. Полы и стены этого помещения должны быть моющимися (в идеале - кафельными) и не содержать материалов, накапливающих пыль. Влажную уборку проводят с использованием дезинфицирующих агентов. Для надежности стерилизации перед началом работы помещение лаборатории и внутреннее пространство ламинара облучают УФ-лучами.

При длительном воздействии УФО лучи вызывают гибель всех бактерий. Бактерии погибают очень быстро, а споры грибов значительно медленнее. Поэтому в боксах устанавливают бактерицидные лампы БУФ-15 или БУФ-30, которые включаются на 30 минут за 1 час до работы. Кроме того, рекомендуется проводить профилактическое облучение боксов в течение 2 часов.

Непосредственно перед работой необходимо протереть внутренние поверхности ламинара этиловым спиртом, разложить в нем необходимые инструменты и материалы: спирт в закрытой посуде, спиртовку (горелку), спички, пинцет, серологические пипетки, резиновую спринцовку и культуральную посуду.

Все операции, связанные с разливом питательных сред, пересевом клеточных культур проводят в ламинарах. Ламинарный бокс (ламинар) - приспособление для работы в стерильных условиях (рис. 1).

 

 

Рис. 1. Ламинарный бокс 2-го класса защиты.

Асептические условия в ламинаре создаются с помощью отсекающего потока воздуха. Ток воздуха, проходя через хепа-фильтры ламинара, движется к исследователю, что позволяет освобождать внутреннее пространство ламинара от спор микроорганизмов.

При работе с культурами животных клеток требования к стерильности более жесткие по сравнению с растительными культурами, поскольку вероятность контаминации выше.

Не рекомендуется в одних и тех же боксах вести работы с микробиологическими объектами и культурами клеток. Микроорганизмы более устойчивы к внешним факторам, и простерилизовать после работы с ними помещение гораздо труднее.

Все изложенное выше касается работ с непатогенным материалом. Уровни защиты при работе с патогенным материалом иные, и они требуют обеспечения большей безопасности.

Стерилизация

Существуют разные методы стерилизации: с помощью влажного пара, сухого пара, облучения ультрафиолетовыми лучами, обработки химическими веществами и микрофильтрации.

 

Стерилизация посуды. Большинство клеточных культур в лабораторных условиях выращивают в культуральных матрасах, чашках Петри одно- или многоразового использования. Вначале посуду тщательно моют с использованием детергентов, а также раствора двухромовокислого калия в серной кислоте (хромпика). Вымытую посуду ополаскивают водопроводной, затем дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу (рис. 2, а). Чтобы избежать заражения стерильных предметов из воздуха, перед стерилизацией их закрывают ватными пробками, заворачивают в оберточную бумагу или закрывают фольгой (у стаканов, колб достаточно завернуть только горлышко). Затем посуду можно стерилизовать двумя способами:

Посуду выдерживают в автоклаве (рис. 2, б) под давлением в течение 20-40 минут при температуре 100-130°С. Продолжительность автоклавирования зависит от его режима: при давлении 0.5 атмосферы - 20-40 минут, при 1 атм. - 15 минут.

а                                              б

Рис. 2. Оборудование для стерилизации инструментов. а: автоклав Euroklav 23 V-S (Евроклав); б: - универсальный сушильный шкаф Memmert серии UNB.

 

При сухом способе стерилизации посуду, завернутую в плотную бумагу, стерилизуют в сушильном шкафу при температуре 140°С в течение 2 часов, при температуре 180°С - 30 минут. При более высоких температурах ватные пробки буреют, а бумага становится ломкой.

 

Стерилизация инструментов. Инструменты (скальпели, пинцеты, иглы и т.д.) стерилизуют в сушильном шкафу. Шприцы и ножницы удобнее кипятить. Металлические предметы нельзя автоклавировать: под воздействием пара они ржавеют и тупятся. Непосредственно перед работой и в процессе её инструменты помещают в стакан со спиртом и обжигают в пламени спиртовки. Стерильный инструмент используют только для одноразовой манипуляции! Перед повторным употреблением его снова окунают в спирт и обжигают. При работе все операции следует проводить в непосредственной близости от зажженной горелки, чтобы обеспечить максимальную защиту растворов от заражения.

 

Стерилизация материалов. Вату, марлю, ватные пробки, фильтровальную бумагу, халаты, косынки стерилизуют в автоклаве под давлением 2 атм. в течение 25-30 мин.

 

Холодная стерилизация. Органические жидкости, не выносящие нагревания, освобождаются от бактерий при пропускании через стерильные мелкопористые бактериальные фильтры с диаметром пор 0.45 мкм.