Глава 3. Результаты собственных исследований

Результаты исследования сывороток крови на наличие ВГС методом ПЦР «в режиме реального времени»

В результате исследования 37 образцов сывороток крови носительство вируса гепатита С установлено в 18 случаях. На рисунке 3.1 показан один из результатов выявления вируса гепатита С в программе ПЦР «в режиме реального времени»:

 

Рисунок 3.1 – Результат накопления РНК вируса гепатита С в одной лунке

Анализ и учёт результатов всех исследуемых образцов проводили в соответствии следующих правил:

1. Анализируемый образец учитывается как отрицательный (не содержащий РНК ВГС), если для этого образца значение Ct по каналу «ROX» больше 40 или не определяется. Если для такого образца значение Ct ВКО отличается от значения (Ct ВКО)_ср более чем на 2, то результат по данному образцу не подлежит анализу и учету как отрицательный. В этом случае необходимо провести повторный анализ данного образца, начиная с этапа выделения (повторный забор крови и повторное проведение анализа).

2. Анализируемый образец считается положительным, т.е. содержащим РНК ВГС, если для этого образца значение Ct по каналу «ROX» меньше или равно 40. Если для такого образца Ct ВКО отличается от значения (Ct ВКО)_ср более чем на 2, то такой образец учитывается как положительный без указания концентрации РНК. Для количественного анализа необходимо провести повторный анализ данного образца, начиная с этапа выделения.

3. В случае контаминации все положительные результаты по данной индивидуальной постановке ПЦР считаются недостоверными (требуется ликвидация источника контаминации и повторный анализ всех образцов данной постановки). Образцы, анализ которых дал отрицательный результат, следует учитывать как отрицательные.

4. Если для СПКО значение Ct ВГС больше 40 или не определяется, то все отрицательные результаты считаются недостоверными и требуют перестановки [53].

Для количественного анализа рассчитывали концентрацию РНК ВГС в исследуемых образцах с применением сервисной компьютерной программы «РеалБест Диагностика», которая приводит результаты в виде таблицы с концентрациями РНК ВГС в анализируемых пробах.

 

 

 

Рисунок 3.2 – Программа «РеалБест Диагностика» для количественного учёта результатов концентрации РНК ВГС

 

В случае отсутствия указанного программного обеспечения или при постановке реакции на приборах количественный анализ специфической вирусной РНК производили по приведённой ниже формуле 3.1:

 

СОБРk = CПКО × 2(Ct ПКО – Ct ОБРk) × 2(Ct ВКОk – Ct ОБРПКО),

(3.1)

 

где k – номер образца;

C_ПКО – концентрация ПКО, указанная во вкладыше к набору;

Сt ПКО и Ct ВКО_ПКО – значения Сt данного образца ПКО по каналам ВГВ/ВГС/ВИЧ и FAM, соответственно;

Ct ОБР_k и Ct ВКО_k – значения Ct данного k-ого образца по каналам «ROX» и «FAM» соответственно.

При условии выделения РНК из образца объёмом 1 мл, полученное значение соответствует концентрации РНК ВГС в МЕ/мл. Если выделение РНК образца производилось из меньшего объёма, полученное значение следует умножить на µ, где µ = 1/объём образца в мл. Таким образом будет получена концентрация РНК ВГС в МЕ/мл. Диапазон определяемых концентраций (область линейности): от 15 МЕ/мл до 10⁸ МЕ/мл РНК ВГС при выделении РНК из 1 мл пробы.

Для определения вирусной нагрузки в копиях РНК ВГС на мл применяли соотношение МЕ = 2,5 копии РНК ВГС (WHO 2nd International Standard for Hepatitis C Assays NIBSC Code: 96/ 798).

Результаты исследований сывороток крови на наличие ВГС, а также качественный и количественный учёт результатов представлены в таблице 1.

 

Таблица 1. – Результаты исследования сывороток крови на наличие ВГС методом ПЦР «в режиме реального времени»

№ образца п/п	ПЦР «в режиме реального времени»
Качественное определение	Количественное определение
МЕ/мл	копий/мл
1.	+	88 200	220 500
2.	+	1 390	3 475
3.	–	–	–
4.	–	–	–
5.	+
6.	–	–	–
7.	+	1120; 970	2 425
8.	+	149 470	373 675
9.	+	31 864	79 660
10.	–	–	–
11.	+	2 932	7 330
12.	+	10 939	27 347
13.	+	6 699	16 747
14.	+	7 536	18 840
15.	+	2 082 140	5 205 350
16.	–	–	–
17.	+	2 740	6 850
18.	+	33 217	83 043
19.	–	–	–
20.	+	23 816	59 540
21.	+	32 943	82 357
22.	–	–	–
23.	–	–	–
	–	–	–
25.	–	–	–
26.	+	16 494	41 235
27.	–	–	–
28.	+
29.	–	–	–
30.	+	8 346	20 865
31.	–	–	–
32.	–	–	–
33.	–	–	–
34.	–	–	–
35.	–	–	–
36.	–	–	–
37.	–	–	–