Выделение гликогена из дрожжевых клеток и его количественное определение

 

Принцип данного метода основан на том, что соединения, содержащие глюкозу, при нагревании в серной кислоте дают с антроном окрашенные растворы. По интенсивности окраски судят о количестве искомого соединения.

Для разрушения простых сахаров, присутствующих в исследуемых образцах (дрожжевых клетках) исследуемую пробу предварительно обрабатывают щелочью.

Ход работы

 

В центрифужную пробирку берут 100 мг клеточной массы дрожжей рода Saccharomyces cerevisiae, культивированных в течении четырех часов в соответствующей питательной среде и накопивших в клетках гликоген, добавляют 3 мл 30%-ного раствора КОН. Пробирки закрывают пробками и помещают в кипящую водяную баню на 20 мин. После этого раствор охлаждают до комнатной температуры, содержимое пробирок количественно переносят в мерные колбочки на 25 - 50 мл в зависимости от содержания гликогена в пробах (1 мл получаемого раствора должен содержать от 3 до 30 мкг гликогена) и объем доводят водой до метки. В широкие пробирки берут по 2,5 мл полученного раствора, ставят их в лед, добавляют при встряхивании 5 мл свежеприготовленного раствора антрона, перемешивают, погружают на 10 мин в кипящую водяную баню,

Через 10 мин пробы охлаждают в бане с ледяной водой и развившуюся зеленую со слабым синеватым оттенком окраску фотометрируют при 620 нм (окраска стабильна при комнатной температуре в течение нескольких часов).

Параллельно с исследуемым раствором ставят контрольную пробу с дистиллированной водой.

Для расчета содержания гликогена найденное по калибровочному графику количество глюкозы (калибровочный график строится по глюкозе) делят на коэффициент 1,11, так как молекулярный вес глюкозного остатка в гликогене равен 162, а молекулярный вес глюкозы - 180 (180:162=1,11).

 

Построение калибровочного графика для определения концентрации гликогена в биологическом материале.

 

График позволяет определить количество глюкозы в пробе, по которому и ведется пересчет содержания гликогена.

 

Реактивы:

1. Антрон - 0,2%-ный раствор, приготовленный на 95%-ном растворе H₂SO₄.Раствор готовят в день определения.

2. Глюкоза - стандартный раствор (1 мл содержит 40 мкг глюкозы).

3. КОН - 30%-ный раствор.

 

Для построения калибровочного графика из стандартного раствора глюкозы готовят ряд разведений. В широкие пробирки, стоящие во льду, помещают по 2,5 мл исследуемых растворов, (от 10 до 100 мкг глюкозы в пробе), и при встряхивании приливают по 5 мл свежеприготовленного раствора антрона. Пробы тщательно перемешивают и ставят в кипящую водяную баню. Через 10 мин пробы охлаждают в бане с ледяной водой и развившуюся зеленую со слабым синеватым оттенком окраску фотометрируют при 620 нм (окраска стабильна при комнатной температуре в течение нескольких часов). Одновременно с исследуемыми растворами ставят контрольную пробу с дистиллированной водой. По полученным данным сроят калибровочный график.

 

Лабораторная работа №11

Спектрофотометрическое определение суммарного содержания нуклеиновых кислот в дрожжевых клетках

 

Методы количественного определения нуклеиновых кислот, основанные на спектрофотометрии в ультрафиолетовой области спектра, отличаются высокой чувствительностью и простотой проведения анализа. Необходимым этапом различных методов спект-рофотометрического определения нуклеиновых кислот является их экстракция из биологического материала, сопряженная с гидролизом полинуклеотидов. В связи с этим следует иметь в виду, что из исследуемого материала предварительно необходимо удалить свободные нуклеотиды.

В основе модификации спектрофотометрического метода определения суммарного содержания нуклеиновых кислот, предложенной А. С. Спириным, лежит экстракция их из биологического материала горячей хлорной кислотой с последующим определением поглощения экстрактов в ультрафиолетовой области спектра при 270 и 290 нм. Расчет содержания нуклеиновых кислот производится по формуле, предложенной автором.

 

Реактивы:

1. НСlО₄ - 0,2 М и 0,5 М растворы.

 

Ход работы

 

Для исследования используют навеску биомассы пекарских дрожжей (100 – 200 мг), которую помещают в центрифужную пробирку с 5 - 10 мл охлажденного 0,2 М раствора хлорной кислоты. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и осадок отделяют центрифугированием на холоде (3000 g, 10 мин). Центрифугат отбрасывают и осадок повторно отмывают хлорной кислотой. Такая предварительная обработка материала необходима для удаления кислоторастворимых нуклеотидов. После удаления центрифугата к осадку добавляют 5 - 10 мл 0,5 н. раствора НСlО₄ и, закрыв пробирки пробками с воздушным холодильником, нагревают их в кипящей водяной бане в течение 30 мин. Эта процедура обеспечивает количественную экстракцию нуклеиновых кислот из исследуемого материала и их кислотный гидролиз до растворимых фрагментов. Гидролизаты охлаждают, центрифугируют и на спектрофотометре определяют в центрифугате поглощение в ультрафиолетовой области спектра при 270 и 290 нм против контрольного раствора - 0,5 М НСlО₄. По данным рассчитывают содержание фосфора нуклеиновых кислот в 1 мл исследуемого раствора, пользуясь формулой:

 

где 0,19 - поглощение 1 мкг фосфора нуклеиновых кислот, содержащегося в 1 мл раствора.

Для пересчета количества нуклеинового фосфора на количество нуклеиновых кислот пользуются средним пересчетным коэффициентом 10,3:

Смкг НК = Смкг*10,3

Рекомендуется проводить дополнительное определение оптической плотности при 260 нм; оптическая плотность при 260 и 270 нм не должны различаться более чем на ±15%.

 

Лабораторная работа №12