Культивирование микробов в лабораторных условиях

Для культивирования бактерий применяют питательные среды. Они могут быть естественными (молоко, морковь, картофель), искусственными (готовят специально). Питательные среды могут быть жидкие и плотные. В зависимости от свойств микробов используют разные среды. Их делят на 4 группы:

1) простые (универсальные) - на них растут только неприхотливые (не требовательные к питательному субстрату) микробы (стафилококки, кишечная палочка). Это МПА и МПБ - мясопептонный агар и бульон.

2) сложные (специальные) - на них растут прихотливые микробы (стрептококки, пневмококки). Они готовятся из простых сред путем их обогащения:

- сахарный агар,

- кровяной агар.

3) элективные (избирательные) - на них растет только один род микробов, а другие – нет. Например: 1%щелочная пептонная вода - для холерного вибриона, сахарный агар - для стрептококка, сывороточный агар - для дифтерийной палочки и т.д.

4) дифференциально-диагностические - для отличия одного вида от другого по ферментативной активности (среда Эндо, Гисса).

Требования к питательным средам:

- питательность

- изотоничность

- оптимальная реакция среды (рН 7.2 – 7.4)

- влажность

- стерильность

- буферность

- унифицированность

Питательные среды (состав некоторых питательных сред)

Кровяной агар. Используют для выявления экзотоксина – гемолизина у бактерий. К расплавленному и охлажденному до 45°С МПА (2% агара) стерильно добавляют 5-10% дефибринированной стерильно взятой крови лошади, кролика или барана.

Пептонная вода. Используют для культивирования холерных вибрионов. Основной раствор пептона: пептона - 100 г, хлорида натрия -50 г, нитрата калия - 1 г, карбоната натрия - 25 г, воды дистиллированной - 1 л; рН 9,0. Стерилизуют при 120°С 20 мин. Для получения пептонной воды основной раствор разводят водой в 10 раз, доводят рН до 8,8-8,9, стерилизуют.

Свернутая сыворотка. Применяют для культивирования прихотливых бактерий (например, дифтерийной палочки). Для приготовления свернутой сыворотки используют нормальную лошадиную сыворотку или сыворотку крупного рогатого скота. Можно пользоваться человеческой сывороткой (отходами производства гамма-глобулина). Для свертывания сыворотку стерильно разливают в стерильные пробирки по 3 мл. Пробирки укладывают в ряд (скос должен начинаться от дна пробирки) в аппарате для свертывания, подогретом до 50⁰C. Температуру доводят постепенно до 80⁰C и держат в нем пробирки 1 ч. Затем пробирки со свернутой сывороткой вынимают (так как дальнейшее нахождение их в свертывателе ведет к высыханию сыворотки) и охлаждают при комнатной температуре. Свернутая сыворотка должна обязательно содержать конденсационную воду.

Среды Гисса с углеводами. Дифференциально-диагностическая среда, на которой выявляют разложение углеводов микроорганизмами. Пептон - 10 г, хлорид натрия - 5 г, углевод - 10 г, реактив Андреде - 10 мл, вода дистиллированная до 1000 мл, рН после стерилизации 7,2-7,4.

Мясопептонный агар (МПА). Применяют для выращивания большинства сапрофитных бактерий. К готовому МПБ добавляют 2% агар и оставляют для набухания 30 мин. Кипятят до полного растворения агара. Стерилизуют 30 мин при 120°С.

Среда 199. Используют для выращивания культур клеток. Синтетическая среда, содержащая аминокислоты, витамины, глюкозу, минеральные соли. Для выращивания клеток (как ростовую) среду используют с добавлением 5-10% коровьей или лошадиной сыворотки. Трипсин используется при получении культуры клеток для дезагрегации тканей, т.е. для разобщения клеток.

Среда Эндо. Дифференциально-диагностическая среда для культивирования бактерий кишечной группы. Готовят непосредственно перед применением. К 100 мл МПА (рН 7,6) при температуре 70°С стерильно добавляют 5 мл 20% раствора лактозы и смесь 0,5 мл насыщенного раствора основного фуксина с 1,25 мл свежеприготовленного раствора сульфата натрия.

Среда Левенштейна-Йенсена. Используют для культивирования микобактерий туберкулеза. Для приготовления этой среды в 600 мл дистиллированной воды, содержащей 12 мл глицерина, растворяют: аспарагина 3,6 г, фосфата калия однозамещенного 2,4 г, сульфата магния 0,24 г, цитрата магния 0,6 г, картофельной муки 5 г, малахитового зеленого 0,4 г. Полученную смесь стерилизуют 15 мин при 120 °С. Готовят 1000 мл однородной суспензии из свежих яиц. Добавляют стерильно в яичную взвесь основной солевой раствор, подогретый до 45-60°С, тщательно перемешивают, избегая появления пузырьков воздуха, фильтруют через ватно-марлевый фильтр, разливают в пробирки и оставляют для свертывания в наклонном положении при 85°С 45 мин.

Желточно-солевой агар (ЖСА). Среда позволяет дифференцировать стафилококки, продуцирующие лецитиназу, от стафилококков, не выделяющих данный фермент, по образованию зон помутнения с перламутровым оттенком вокруг колоний лецитиназоположительных видов. Содержит повышенные концентрации хлорида натрия (8-10%), которые препятствуют размножению других микробов, что обеспечивает элективность среды. Готовят среду из питательного солевого агара. В расплавленный и остуженный до 45 ⁰С агар добавляется куриный желток.

Среда Сабуро. Предназначена для выращивания дрожжевых и плесневых грибов. Содержит пептон -10,0 г/л; глюкозу - 40,0 г/л; агар-агар — 15,0 г/л. Благодаря содержанию 4% глюкозы наблюдается оптимальный рост грибов, а рН 5,6 подавляет рост бактерий.

Тиогликолевая среда. Используют для культивирования и выделения облигатных и факультативных анаэробов и микроаэрофильных бактерий и теста на стерильность различных биоматериалов. Казеиновый пептон 15,0; дрожжевой экстракт 5,0; глюкоза 5,5; L-цистин 0,5; хлористый натрий 2,5; тиогликолят натрия 0,5; резазурин натрия 0,001; агар-агар 0,75. Редуцирующие вещества, такие как тиогликолят и цистин - обеспечивают анаэробные условия, достаточные даже для строгих анаэробов. Более высокая вязкость жидкой тиогликолевой среды защищает растущую культуру от быстрого проникновения кислорода. Любое увеличение содержания кислорода регистрируется окислительно-восстановительным индикатором резазурином натрия, который при этом краснеет. Инокулируют питательную среду исследуемым материалом, следя за тем, чтобы он попал на дно пробирки. Для создания анаэробных условий, на поверхность питательной среды можно наслоить стерильное парафиновое масло или агар-агар высотой 1 см. Инкубировать в течение нескольких дней при оптимальной температуре 37^оС. Анаэробы растут в нижней части пробирки.

К работе № 3, 4