Концентрированных серной и азотной кислот

(метод Равданикиса)

1-колба Къельдаля, 2-делительная воронка с раствором азотной кислоты

Тщательно измельчённый биологический материал (100 г) помещают в колбу Къельдаля и заливают смесью, состоящей из равных объемов воды, концентрированной серной и концентрированной азотной кислот, из расчёта 75 мл смеси на 100 г биологического материала. 3атем колбу с объектом закрепляют в штативе таким образом, чтобы дно её находи­лось на расстоянии 1-2 см от асбестовой сетки, и начинают осторожно (во избежание обугливания) нагревать. В процессе минерализации к содержимому колбы время от времени добавляют по каплям азотную кислоту с водой, регулируя введение ее таким образом, чтобы она по возможности полно расходовалась на минерализацию (окрашенные газообразные окислы азота не должны по возможности выходить из колбы).

Первая стадия минерализации заключается в разрушении форменных элементов и продолжается при не очень жирном объекте исследования 30-40 минут. По окончании первой стадии минерализации получают прозрачную жидкость, окрашенную в бурый или жёлтый цвет (при жирном объекте на поверхности жидкости может наблюдаться слой жира).

После разрушения форменных элементов колбу с объектом исследования опускают на асбестовую сетку и усиливают нагревание, стремясь избежать обугливания объекта. Постоянно добавляя азотную кислоту (1:1), продолжают минерализацию до тех пор, пока полученная бесцветная жидкость при нагревании в течение 30 минут без добавления азотной кислоты и выделении тяжёлых белых паров не будет больше темнеть. В таком случае операцию минерализации можно считать законченной.

На минерализацию при нежирном объекте исследования обычно затрачивается 6-8 часов

По охлаждении минерализата его проверяют на наличие азотсодержащих веществ по реакции с дифениламином, для чего 1-2-капли минерализата смешивают с 1-2- каплями дистиллированной воды и каплю этого раствора вносят в раствор дифениламина в концентрированной серной кислоте. При наличии синей окраски делают вывод о необходимости денитрации.

1.2. Минерализация биологического материала смесью серной, азотной и хлорной кислот (метод Каана)

100 г измельчённого биологического материала помещают в колбу Къельдаля, заливают 25 мл концентрированной азотной кислоты и 35 мл 42-57% раствора хлорной кислоты. Колбу Къельдаля помещают на асбестовую сетку и осторожно нагревают до разрушения форменных элементов.

При сильном вспенивании прекращают нагревание и добавляют по каплям (1-3 капли) изоамиловый спирт (пеногаситель).

1-колба для окисления объекта,2-воронка для введения кислот в процессе минерализации, 3-коллектор,4-холодильник шариковый, 5-улавливающая насадка

По окончании деструкции нагревание временно прекращают, деструктат слегка охлаждают, и к охлаждённой жидкости по каплям добавляют 25 мл концентрированной серной кислоты. После этого нагревание усиливают и продолжают окисление при периодическом добавлении концентрированной кислоты (при потемнении или обугливании жидкости) до тех пор, пока добавление очередной порции азотной кислоты не станет вызывать энергичного закипания. В этом случае нагревание ослабляют, и окисление заканчивают, добавляя ещё некоторое время разбавленную азотную кислоту (2:10).

Окончанием процесса минерализации считают одномоментное просветление жидкости. По окончании окисления минерализат нагревают ещё в течение 5-10 минут для удаления избытка хлорной кислоты.

В конце минерализации проводят ксантопротеиновую реакцию на наиболее трудно окисляемые аминокислоты. Капля охлаждённого до 50-70⁰С минерализата, разбавленная 1-2 каплями дистиллированной воды. При добавлении 25% раствора аммиака может окрашиваться лишь в слабо жёлтый цвет. На минерализацию 100 г биологического материала затрачивают около 2 часов.

Денитрация минерализата

Полученный минерализат охлаждают, прибавляют 10-15 мл дистиллированной воды и нагревают до 110-130^оС, а затем осторожно по каплям (избегая избытка) прибавляют формалин.

При этом отмечается обильное выделение бурых (иногда оранжевых) паров.

После окончания выделения этих паров жидкость ещё нагревают 5-10 мин, а затем 1-2 капли охлаждённой жидкости (минерализата) наносят на предметное стекло или на фарфоровую пластинку и прибавляют каплю раствора дифениламина в концентрированной серной кислоте. Отрицательная реакция минерализата с дифениламином на азотную, азотистую кислоты и окислы азота указывает на окончание процесса денитрации. При положительной реакции минерализата с дифениламином денитрацию проводят повторно.