Определение триглицеридов в сыворотке крови с ацетилацетоном.

Принцип метода:

Триглицериды омыляются едким кали с образованием глицерина, при окислении которого образуется формальдегид.

Реактив, содержащий ацетилацетон, взаимодействует с формальдегидом с образованием 3,5-диацетил-1,4-дигидролутидина, окраску которого измеряют.

Материал для исследования:

1. Сыворотка крови;

2. Плазма (антикоагулянт – ЭДТА).

Реактивы:

1. Изопропанол;

2. Адсорбент;

3. Раствор КОН;

4. Окислительный раствор;

5. Реактив, содержащий ацетилацетон;

6. Стандартный раствор триглицеридов.

Ход определения:

№	Реактивы		Раствор сравнения		Эталон		Проба
1. 2. 3. 4.	Дистиллированная вода (мл) Эталонный раствор (мл) Сыворотка крови (мл) Изопропанол (мл)		0,1 - - 4,0		- 0,1 - 4,0		- - 0,1 4,0
Перемешивают и добавляют с помощью мерной ложечки
5.	Адсорбент (г)		0,4		0,4		0,4
Встряхивают (10-15 мин), центрифугируют 5 мин. при 3000 об/мин.
6. 7.	Супернатант (мл) Раствор КОН (мл)	2,0 0,5		2,0 0,5		2,0 0,5
Содержимое пробирок перемешивают, пробирки закрывают пробками, инкубируют 5-10 мин. при температуре 60º±2ºС. После этого охлаждают в холодной воде и добавляют
8.	Окислительный раствор (мл)		0,5		0,5		0,5
Содержимое пробирок после добавления окислительного раствора немедленно перемешивают и оставляют стоять при комнатной температуре 10 мин. Добавляют:
9.	Реактив (мл)

Содержимое пробирок перемешивают, неплотно закрывают пробками и раствор инкубируют точно 30 мин. при температуре 60º±2ºС. После охлаждения измеряют оптическую плотность пробы и эталона против раствора сравнения в кювете 0,5 см при длине волны 410 нм.

Расчет результатов:

По оптической плотности пробы D_о и эталона D_ст рассчитывают содержание ТГ (х) в ммоль/л пробы по формуле:

	Dо
С =	--------------	* Сст
	Dст

 

 

С_ст = 3,39 ммоль/л

Коэффициенты пересчета мг/дл * 0,113 = моль/л

                                       ммоль/л * 88,55 = мг/дл

Примечания:

Экстракцию проводят в центрифужных пробирках, закрытых полиэтиленовыми или стеклянными пробками.

Адсорбент дозируют с помощью мерной ложечки, входящей в набор (около 0,4 г).

Омыление и прочие реакции проводят в тонкостенных пробирках объемом 15 мл, неплотно закрытых пробками.

Проведение испытания можно приостановить до следующего дня в стадии омыления КОН (после охлаждения пробирки необходимо хорошо закрыть, чтобы раствор не испарялся), но проведение испытания во времени при окислительной и цветной реакциях необходимо строго соблюдать.

Если проба хранится при температуре -20ºС, содержание ТГ в плазме остается неизменным в течение 8 недель.

При длительном хранении при комнатной температуре липаза сыворотки разлагает ТГ на свободные жирные кислоты.

До приобретения определенного опыта рекомендуется проводить дублированный анамнез. В одной серии должно обрабатываться не более 20 проб.

Применяемая посуда должна быть очищена от жирных загрязнений и синтетических моющих средств.

Если полученные величины превышают 4,5 ммоль/л, сыворотку разводят водой в соотношении 1:1 (а результат умножают на 2).

Отбор пробы для определения ТГ должен проводиться после не менее чем 14-часового воздержания от пищи. Слабый гемолиз не влияет на определение.  

Определение ТГ ферментативным методом.

Принцип метода:

ТГ расщепляются под действием фермента до глицерина и жирных кислот. Глицерин подвергается дальнейшим превращениям с образованием перекиси водорода. Перекись водорода взаимодействует с реактивом с образованием окрашенных соединений, интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации ТГ.

Исследуемый материал:

1. Сыворотка крови;

2. ЭДТА – плазма (без следов гемолиза).

Реактивы:

1. Реагент № 1 буфер;

2. Реагент № 2 лиофилизат;

3. Реагент № 3 стандартный раствор ТГ.

Приготовление рабочего реагента:

Растворить содержимое одного флакона № 2 в 50 мл реагента № 1.

Ход определения:

Реактивы (мл)	Холостая проба	Исследуемая проба	Стандартная проба
Рабочий реагент	2,00мл	2,00мл	2,00 мл
Стандарт	-	-	0,02 мл
Сыворотка (плазма)	-	0,02 мл	-

Тщательно перемешать, инкубировать 5 мин. при температуре 37ºС. Считать значение абсорбции исследуемой пробы и стандартной пробы против холостой пробы при длине волны 520 нм.

Расчет результатов:

	Dо
С =	--------------	* Сст
	Dст

 

С_ст = 2,5 ммоль/л

Нормальное значение ТГ – 0,45-1,86 ммоль/л.

Клинико-диагностическое значение:

Изменение уровня ТГ идет параллельно содержанию общих липидов и существенно зависит от характера питания.

Увеличение концентрации ТГ является одним из решающих показателей для диагностики отдельных типов генетически обусловленных нарушений липидного обмена (первичная или семейная гипертриглицеридемия).

Симптоматическая (вторичная) триглицеридемия наблюдается при:

· ожирении

· циррозе печени алкогольном, билиарном

· сахарном диабете

· гипофункции щитовидной железы

· нефротическом синдроме

· панкреатите остром и хроническом

· злоупотреблении алкоголем

· при употреблении некоторых препаратов: бета-блокаторов, диуретиков и др.

Снижение концентрации ТГ наблюдается при гипертиреозе, синдроме мальабсорбции.

 

БЕТА-ЛИПОПРОТЕИДЫ

Определение β-ЛП проводится по Бурштейну и Самай.

Принцип метода:

В присутствии хлористого кальция и гепарина нарушается коллоидная устойчивость белков сыворотки крови, в связи с чем осаждаются β-ЛП. По степени помутнения судят о содержании β-ЛП в сыворотке.

Материал для исследования: сыворотка крови.

Реактивы:

1. хлористый кальций 0,277%. 2,77 мл хлористого кальция 10% доводят до 100 мл дистиллированной водой.

2. 1% водный раствор гепарина. Готовится перед реакцией смешиванием 0,1 мл гепарина и 0,4 мл дистиллированной воды. Полученный раствор содержит в 1 мл 1000 ед., т.к. во флаконе 25000 ед. в 5 мл или 5000 ед. в 1 мл, а при приготовлении проведено разведение в 5 раз.

Ход определения:

Первое определение. В центрифужную пробирку вносят 2 мл хлористого кальция, приливают 0,2 мл сыворотки и тщательно перемешивают стеклянной палочкой. Определяют оптическую плотность на ФЭКе при красном светофильтре (720 нм), в кювете – 5 мм против дистиллированной воды. Полученный результат записывают – D₁ (обычно 0,01-0,03).

Второе определение. В кювету добавляют 0,04 мл гепарина и одновременно включают секундомер на 4 минуты. Содержимое кюветы тщательно перемешивают. Оптическая плотность возрастает. По истечении 4 минут производят повторное определение оптической плотности – D₂.

Расчет:

1. В относительных единицах – D₂ - D₁

Норма – 0,35-0,55 или 35-55 относительных единиц.

2. В г/л

(D₂ - D₁) * 1,164 * 10

1,164 – стандартный коэффициент, найденный опытным путем

10 – коэффициент пересчета в системы СИ

Норма – 3-5 г/л.

Условия:

1. кровь должна быть взята строго натощак;

2. сыворотка может хранится до 2 суток в холодильнике или при комнатной температуре;

3. при высокой концентрации β-ЛП берут 0,1 мл сыворотки.

Клинико-диагностическое значение:

Изменение содержания β-ЛП происходит параллельно содержанию ХС, т.к. β-ЛП или ЛПНП являются транспортной формой ХС. Поэтому диагностическое значение β-ЛП то же, что и определение ХС и имеет значение при атеросклерозе, сахарном диабете, ожирении, гипотиреозе, заболеваниях печени и т.д.

ХОЛЕСТЕРИН

ХС представляет собой вторичный одноатомный ароматический спирт. Он обнаруживается во всех тканях и жидкостях человеческого организма, как в свободном состоянии, так и в виде сложных эфиров. ХС является важным компонентом клеточных мембран, служит предшественником образования стероидных гормонов и желчных кислот. У практически здоровых людей 2/3 ХС плазмы содержится в составе атерогенных, 1/3 неатерогенных ЛП, свободный холестерин вместе с фосфолипидами составляет основу липидной структуры плазматических и других мембран.

Не менее 10% населения страдает гиперхолестеринемией. Это может привести к серьезным патологическим изменениям сосудистой стенки. Уровень содержания ХС и ТГ являются наиболее важными показателями липидного обмена.

Существует прямая зависимость между увеличением концентрации ХС в плазме и появлением риска атеросклеротического поражения коронарных сосудов.

В норме уровень общего ХС – 3,9-5,2 ммоль/л. При концентрации ХС в диапазоне 5,2-6,5 ммоль/л рекомендуется исследовать содержание ЛПВП-ХС. Больных обследуют спустя 2-4 недели лечения без приостановки диетической и лекарственной терапии; повторяют обследование с интервалом в 3 месяца.

Материалом для исследования служит сыворотка или плазма.

Методы определения ХС многочисленны, значительное распространение получили:

· химический метод (метод Илька) – в настоящее время не используется;

· ферментативный;

· метод «сухой химии».