Список необходимых реактивов и оборудования

 

Необходимое оборудование и реактивы для синтеза РНК гидов

· Механические дозаторы на 10 и 20 мкл и наконечники к ним

· Микропробирки

· Термостат

· Амплификатор

· Настольная микроцентрифуга

· Набор Т7 для синтеза РНК (или отдельные компоненты: Т7 РНК полимераза с буфером, рибонуклеозидтрифосфаты, ДНКаза с буфером)

· Набор для выделения РНК (CleanRNA standard, Euro Gene, или другой аналогичный)

Реактивы и оборудование для расщепления ДНК

· Механические дозаторы на 10 и 20 мкл и наконечники к ним

· Микропробирки

· Термостат

· Настольная микроцентрифуга

· Спектрофотометр

· Вода без нуклеаз

· NEB буфер 3.1

· РНК-гид (на основе найденных спейсеров)

· Cas9 нуклеаза

· ДНК-субстрат

· Протеиназа К

Оборудование и реактивы для проведения электрофореза в агарозном геле

Необходимое оборудование и реактивы для ПЦР с геномной ДНК Streptococcus pyogenes phage 315.3

· ДНК-матрица исследуемого вируса

·  8 праймеров (форвард и реверс) (табл. 1)

· ПЦР Буфер

·  Дезоксинуклеозидтрифосфаты (дНТФ или dNTP)

·  Полимераза

·  Стерильная вода

·  Механические дозаторы 20 мкл, 200 мкл и 1 мл и наконечники к ним

· Микропробирки для амплификатора

· Амплификатор

Необходимое оборудование и реактивы для электрофореза в агарозном геле:

· Агароза

·  TAE-буфер однократный

·  Бромистый этидий

·  Буфер с красителем для нанесения проб на гель

·  ДНК-маркер

·  Механический дозатор 20 мкл, наконечники

·  Столик для заливки агарозного геля

· Рамка и гребенки для заливки агарозного геля

· СВЧ-печь

· Камера и источник питания для проведения электрофореза

· Трансиллюминатор.

· Табл. 1. Праймеры, используемые для определения наличия или отсутствия фрагментов ДНК фага после рестрикции исследуемыми Сas9-sg RNA комплексами.

№	Фрагмент ДНК фага	Праймер
1	Определение фрагмента рестрикции Cas9-sg-RNA на основе Streptococcus pyogenes GCF_001635895 спейсер 5(846495-846560) TTAGAGGCCTATTTCACAGACAAAGACATC Реплицируемый фрагмент: CAGGAGCGGAAGACGGCTTACCTAAAATGCAAGTTATCGAAGCTAGTAAAGCGACGGGGATACTTGACCCAACTACATTTTTATTAACAGAGGGTTATGCAATTTTAGAGTCTGACTCAAACGGTAATCCTACGTTAGAGGCCTATTTCACAGACAAAGACATCTGGTATTATCCAAAAAAAGGGAAACCATATAATATTAAAAATCCAACAGGTCACCCCTTGCTTGTACCTATCATTCACAGACCAGACGCAGTTAGACCATTTGGTCGCAGTCGCATTACCAAGGCTGGAATGTATC	Прямой: AAAGCGACGGGGATACTTGA   Обратный: CTGCGTCTGGTCTGTGAATG
2	Определение фрагмента рестрикции Cas9-sg-RNA на основе Streptococcus pyogenes GCF_001635895 спейсер 9(1222847 -1222912) ACTAGATTCGCCTCACGCTCTCCTCGCCAAATTT Реплицируемый фрагмент: CTGTGTTAGAATGGACCGCTAAAGGGGTTGATAGCCTTGCGGACCGTATTATTTTCAGGGAGTTTACCAACGATGATTTTAATGCTTGGGAAATTTTTAAAGCGAATAACCCTGATATCTTTTTTGATACAGCCATACAGTCAGCATTAATTGCATCTTGTTGCTTTGTGTACATCATGCCAGGAGCGGAAGACGGCTTACCTAAAATGCAAGTTATCGAAGCTAGTAAAGCGACGGGGATACTTGACCCAACTACATTTTTATTAACAGAGGGTTATGCAATTTTAGAGTCTGACTCAA	Прямой: AGCCTTGCGGACCGTATTAT   Обратный: TCAAGTATCCCCGTCGCTTT
3	Определение фрагмента рестрикции Cas9-sg-RNA на основе Streptococcus pyogenes GCF_001635975 спейсер 3(790897-790962) TAGAGGCCTATTTCACAGACAAAGACATC Реплицируемый фрагмент: CAGGAGCGGAAGACGGCTTACCTAAAATGCAAGTTATCGAAGCTAGTAAAGCGACGGGGATACTTGACCCAACTACATTTTTATTAACAGAGGGTTATGCAATTTTAGAGTCTGACTCAAACGGTAATCCTACGTTAGAGGCCTATTTCACAGACAAAGACATCTGGTATTATCCAAAAAAAGGGAAACCATATAATATTAAAAATCCAACAGGTCACCCCTTGCTTGTACCTATCATTCACAGACCAGACGCAGTTAGACCATTTGGTCGCAGTCGCATTACCAAGGCTGGAATGTATC	Прямой: AAAGCGACGGGGATACTTGA   Обратный: CTGCGTCTGGTCTGTGAATG
4	Определение фрагмента рестрикции Cas9-sg-RNA на основе Streptococcus pyogenes GCF_001020185 спейсер 3(1100792-1100857) GGAAAGCAGGAGAAAGGACGTTAATATGTC Реплицируемый фрагмент: TTGCGCACTGGATTTGTTACACAACGAAGCCAAAAAGAAAGCAAAGAACCAGCTGTTAAAAAACGACATCCGAAAGGGTGTTTTTTTACTGCTAAAAAATCTACCGAACTGCCGGGAAAGCAGGAGAAAGGACGTTAAATGTCAGAATTTAAAGTTATTGAAACACAAGAAGAGTTGGACACGATTGTGAAAGCTCGCATTGCTCGAGAACGTGAGAAATATCAAGATTACGACCAACTGAAAACTCGTGTTGAAGAACTAGAAACCGAAAACAGCAGCTTACAAACTGCTTTGATGA	Прямой: GGAAAGCAGGAGAAAGGACG   Обратный: AGCTGCTGTTTTCGGTTTCT