Работа №3. Определение гемоглобина методом Сали.

Гематиновый метод Сали основан на образовании устойчивого раствора коричневого цвета при взаимодействии гемоглобина с НС1.

Гемометр Сали представляет собой штатив, задняя стенка которого сделана из матового стекла. В штатив вставлены 3 пробирки одинакового диаметра. Две крайние пробирки запаяны и содержат стандартный раствор солянокислого гематина; средняя – градуирована. Она предназначена для проведения исследования. Стандартный раствор солянокислого гематина по цвету соответствует 167 г/л гемоглобина.

Ход работы

в среднюю пробирку наливают 0,1 Н р-р НСl до нижней метки. Пипеткой берут 0,02 мл кровиизпальца до метки, обтирают ее кончик ватой и выдувают кровь на дно пробирки так, чтобы верхний слой кислоты оставался неокрашенным. Не вынимая пипетку, споласкивают ее кислотой. После этого содержимое пробирки перемешивают и ставят в штатив на 5–10 мин. Это время необходимо для полного превращения Нb в солянокислый гематин. Затем к содержимому пробирки добавляют по каплям дистил. воду до тех пор, пока цвет полученного раствора не будет совершенно одинаков с цветом стандарта (добавляя воду, раствор перемешивают стеклянной палочкой).

Рекомендации к оформлению работы. Цифра на уровне верхней границы полученного раствора, показывает абсолютное содержание Hb в испытуемой крови, выраженное в г-%. Значение следует перевести в г/л, т. е. умножить на 10.

 

Работа № 4. Определение содержания гемоглобина спектрофотометрически

Для определения гемоглобина используется гемоглобинцианидный метод. Принцип метода состоит в том, что к крови добавляется специальный трансформирующий раствор, содержащий сильный окислитель (цианид), при взаимодействии с которым эритроциты разрушаются, гемоглобин выходит в раствор и образует окрашенное соединение гемоглобинцианид. Интенсивность окраски пропорциональна количеству гемоглобина и фиксируется на спектрофотометре.

Ход работы

В пробирку пипеткой перенесите 5 мл трансформирующего раствора. Выпустить 0,02 мл крови в трансформирующий раствор. Раствор крови в трансформирующем растворе аккуратно, но тщательно перемешайте и оставьте на 10-15 мин при комнатной для полного развития окраски (раствор остается стабильным в течение более 24 ч). Таким же образом подготовьте пробу со стандартным раствором гемоглобина: 5 мл трансформирующего раствора и один капилляр стандартного раствора гемоглобина (120 г/л).

Далее производят измерение оптической плотности на спектрофотометре опытной и стандартной проб при длине волны 520-560нм (зеленый светофильтр) в кювете толщиной 10мм. Предварительно выставляется ноль по трансформирующему раствору.

Рассчитывают коэффициент по формуле:

K =130/ E, где

130 – концентрация гемоглобинцианида в калибраторе в пересчете на гемоглобин, E – оптическая плотность калибратора гемоглобинцианида. При использовании спектрофотометра определение оптической плотности проводят при длине волны 540 нм в кювете толщиной 10мм. Содержание гемоглобина рассчитывают по формуле:

Hb (г/л) = E опыт хК,

где E опыт – оптическая плотность раствора.

Рекомендации к оформлению работы. Рассчитать содержание гемоглобина в крови. Сравнить с нормой.

 

Работа № 5. Расчёт цветового показателя.

Цветовым показателем (ЦП) называютусловную величину, характеризующую степень насыщения гемоглобином каждого эритроцита. Этот показатель можно вычислить, зная содержание гемоглобина в исследуемой крови и количество эритроцитов в 1 мкл этой же крови.

ЦП = Нв (г/л) * 3 / (три первых цифры от числа эритроцитов)

Рекомендации к оформлению работы. В норме цветовой показатель равен 0,85 - 1,15 - нормохромазия.

Превышение ЦП верхнего предела нормы называют гиперхромазией, уменьшение за предел нижнего уровня нормы - гипохромазией.

 

Работа № 6.Определение скорости оседания эритроцитов (СОЭ).

Ход работы

капилляром из прибора Панченкова набрать из флакона 5,0%-ный раствор цитрата натрия до метки 50 (Р) и выпустить раствор на часовое стекло.

Погрузить во флакон с кровью кончик капилляра и, наклоняя капилляр, набрать в него (без пузырьков воздуха) кровь до метки О (К). Затем выпустить кровь в раствор цитрата натрия на часовое стекло. Повторить забор крови из флакона до метки О (К) и эту порцию тоже выпустить на часовое стекло. Таким образом, соотношение цитрата натрия и крови на часовом стекле равно 1:4. Быстро перемешать кровь стеклянной палочкой на часовом стекле. Наклоняя капилляр, набрать в него смесь крови с цитратом натрия до метки О (К), закрыть пальцем верхний конец капилляра, чтобы раствор крови не вытек. Упереть нижний конец капилляра в нижнее резиновое кольцо прибора Панченкова и затем вставить верхний конец капилляра в резиновое кольцо сверху.

Рекомендации к оформлению работы. Отметить время и ровно через час посмотреть, какова высота столбика прозрачной плазмы, т.е. на сколько миллиметров за 1 час осели эритроциты.