Методы оздоровления посадочного материала от вирусной, бактериальной и грибной инфекции

Оздоровление посадочного материала от вирусной, бактериальной и грибной инфекции выполняется на основе одного из трех методов (метод апикальных меристем, метод термотерапии, метод химиотерапии) или их сочетания. Получение свободных от вирусов растений (virus-free plants) является этапом и одной из целей клонального микроразмножения картофеля, плодовых, ягодных, декоративных, лесных растений.

Метод апикальных меристем

Меристема - конус активно делящихся клеток, расположенных на кончике побегов или корней. Для оздоровления используют меристему побегов шириной 0.1 мм и длиной 0.25-0.3 мм. Метод основан на том, что распределение вируса в растении неравномерно и наименьшая концентрация наблюдается в зоне апикальной меристемы. Вычленение апикальной меристемы и высадка ее на питательную среду приводит к снижению концентрации или полной элиминации вируса в дочернем растении после его регенерации из апикальной меристемы.

Существуют несколько теорий, объясняющих отсутствие вирусов в меристеме: медленное распределение вирусов в активно делящихся клетках, подавление размножения вирусов высокой концентрацией ауксинов, влияние компонентов питательной среды.

Авторами метода считаются Ж. Морель и С.Мартин (1952), впервые получившие свободное от вирусов растение георгинов от инфицированного донорного растения. В настоящее время метод получил широкое распространение и используется для оздоровления посадочного материала картофеля, плодовых, ягодных, декоративных растений. Использование метода апикальных меристем само по себе не гарантирует обязательного оздоровления. Вирус может присутствовать в апикальной меристеме в скрытом состоянии. В связи с этим необходимо сочетать метод апикальных меристем с другими методами оздоровления (термо- и химиотерапия) и применять для контроля вирусной инфекции в растении-регенеранте методы электронной микроскопии и/или иммуноферментного анализа. Отмечены случаи, когда свободные от вирусов регенеранты были получены от несущих вирусы апикальных меристем. Вероятно, потеря вирусов в этом случае связана с комбинацией факторов, возникающих при культивировании меристем (состав питательной среды, наличие гормонов и др.)

Какие факторы способствуют элиминации вирусов в культуре меристем? Одним из главных факторов является размер меристемы. Известно, что эффективность оздоровления обратно пропорциональна размеру меристемы, а эффективность регенерации растений из меристемы прямо пропорциональна. Поэтому для каждого растения подбирается оптимальный размер меристемы, обеспечивающий высокий уровень элиминации вирусов и приемлемый выход растений-регенерантов.

Верхушечные почки обеспечивают более высокую эффективность регенерации в сравнении с боковыми (эффект апикального доминирования). Влияние сезона и физиологического состояния растения на эффективность регенерации рассматривалось нами ранее. К примеру, для картофеля оптимален период после выхода клубня из состояния покоя. Эксплант (кончик побега), используемый для вычленения меристемы, стерилизуется в 75-95 % этаноле и /или 0.1 -.0.5 % гипохлорите натрия с последующим многократным промыванием в стерильной воде. Вычленение меристемы производится в ламинар-боксе в стерильных условиях под бинокулярным микроскопом. Размер вычленяемой меристемы 0.5 -+ 0.2 мм.

Для культивирования апикальных меристем используют обычно модификацию среды Мурасиге и Скуга, подбирая гормональный состав, оптимальный для культуры. Применяется невысокая концентрация регуляторов роста (0.1-0.5 мг/л); ауксины могут быть необходимы для образования корней, ауксины и цитокинины - для стимуляции клеточного деления, гибберелловая кислота иногда добавляется для удлинения побегов. Нормальной для культивирования меристем является температура 21-25 0 С, для луковичных растений требуется более низкая температура. Оптимальная длина дня - 14-16 часов.

Термотерапия

Тепловая обработка растений в культуре in vivo или in vitro обычно предшествует вычленению апикальных меристем. Термотерапия (лечение зараженных вирусными болезнями растений длительным воздействием на них повышенных температур) способствует элиминации вирусов в инфицированных растениях. Механизм этого процесса до конца не изучен. Предполагаются следующие возможные причины элиминации вирусов в результате тепловой обработки растений: инактивация имеющихся вирусов, увеличение темпа синтеза вирусных частиц с последующей деградацией, блокирование синтеза РНК вируса, уменьшение движения вируса к быстрорастущей апикальной меристеме. Различные вирусы по разному относятся к термотерапии. Так, например, вирусы картофеля располагаются в порядке увеличения трудности элиминации под действием термотерапии в следующем порядке: вирусы L, А, Y, F, М, Х, S, вироид веретеновидности клубней.

Термотерапия выполняется обычно при температуре, не угнетающей развитие растений и подавляющей развитие вирусов. Наиболее часто используется температура 36-38 0 С. Для выполнения термотерапии растения, черенки или клубни помещают в термокамеры, где в течение первой недели температуру увеличивают от 250 до 37 0 С путем ежедневного увеличения на 2 0 С. Освещенность 3,5-5тыс. люкс, фотопериод 14-16 часов в сутки, влажность 75-90 %. Термотерапию клубней картофеля выполняют в темноте в условиях термобокса, в результате получают этиолированные ростки.

Продолжительность термотерапии зависит от культуры, сорта и состава вирусов инфицированного растения. Если для картофеля оптимальная продолжительность составляет около 4 недель, то для хризантем - более 12 недель.

Для некоторых культур, угнетаемых под действием высокой температуры in vivo (розы, луковичные и др.) целесообразна термотерапия в культуре in vitro.

Эффективность термотерапии различна и зависит от особенностей культуры. Термотерапия особенно полезна для плодовых деревьев, где культура меристем затруднена. Для культуры картофеля метод недостаточно эффективен в связи с риском распространения вироида веретеновидности клубней. клональный микроразмножение клубневый репродукция

Химиотерапия

Метод предполагает использование химических соединений - ингибиторов вирусов, которые добавляются в состав питательной среды. Наиболее часто для этих целей применяют 1 в- Д- рибофуранозил -1,2,4 - триазол - 3 карбоксимид (коммерческое название виразол). Виразол стерилизуется путем фильтрации и добавляется в охлажденную среду. Концентрации препарата зависят от вида растений (1- 100 мг/л), длительность обработки подбирается эмпирически. По мере возрастания концентрации усиливается процесс элиминации вирусов, однако при концентрации выше 20-50 мг/ л уменьшается темп роста и может наблюдаться фитотоксический эффект. Виразол показал высокую эффективность при оздоровлении картофеля, черешни, сливы, малины, декоративных растений.

В Белорусском НИИ картофелеводства успешно испытан метод оздоровления посадочного материала картофеля на основе применения 2-5- олигоаденилатов - соединений, относящихся к классу олигонуклеотидов и являющихся посредниками противовирусного действия интерферона. Для 2-5- олигоаденилатов обнаружен большой спектр биологической активности, включая противовирусную, фитостимулирующую, цитокининоподобную и др.