Клональное микроразмножение плодовых и ягодных растений

В соответствии с мировой практикой в Беларуси посадочный материал подразделяется на 3 класса: класс А (virus free - свободный от вирусов), класс Б (virus test -тестированный на вирусы) и класс В (visual healthy - визуально здоровый). Для получения посадочного материала класса А необходимы тщательный отбор, оздоровление и тестирование исходных растений на наличие вирусных и микоплазменных заболеваний. Растения класса А являются основным, а в перспективе - единственным видом посадочного материала. Необходимость оздоровления исходных растений связана с широким распространением вирусов среди плодовых и ягодных растений в республике. В БНИИ плодоводства методом иммуноферментного анализа изучена распространенность 8 вирусов яблони, сливы, алычи, вишни и черешни в посадках института. Установлена высокая степень инфицированности яблони вирусом хлоротической пятнистости листьев (87% растений), меньшая инфицированность вирусом мозаики яблони (11%) и желобчатости ствола яблони (13%). В посадках сливы и алычи широко распространены вирус мозаики яблони и карликовости сливы (37 и 47% соответственно), а в посадках вишни и черешни - вирус мозаики яблони (45%). Многие исследованные образцы содержат более чем один вирус, обнаружены также растения, которые можно использовать для создания маточника безвирусных плодовых деревьев (класс Б) или оздоровления (класс А). Тестирование земляники садовой и смородины черной на наличие 6 вирусов выявило очень высокий уровень инфицированности. Только 9 % растений земляники оказались свободны от вирусов, не обнаружено ни одного здорового растения смородины черной. Высокий уровень распространения вирусов снижает продуктивность плодовых и ягодных растений, для получения качественного посадочного материала класса А необходимы термотерапия и культура in vitro.

Наибольшее распространение для микроразмножения плодовых и ягодных культур получил метод пролиферации придаточных побегов. Для снятия эффекта апикального доминирования в этом случае используются цитокинины. Процесс происходит по описанной ранее схеме и имеет некоторые особенности, связанные со спецификой культур.

На этапах 0 и 1 важными являются предподготовка растения, правильный выбор сроков взятия эксплантов (период выхода из состояния покоя и активной вегетации). На этих этапах проводится оздоровление посадочного материал, для чего применяют метод апикальных меристем в сочетании с термотерапией. Для термотерапии плодовых культур используют однолетние саженцы, которые культивируют в термокамерах при температуре 38 +- 1 С, относительной влажности 70-80%, освещенности 5-6 тысяч люкс, длине дня 16 часов в течение 5-11 недель. После термотерапии срезают верхушки побегов, промывают водой 2 часа, стерилизуют в 0.1%-ном растворе сулемы 6-12 минут, промывают стерильной дистиллированной водой и вычленяют под микроскопом в ламинар-боксах апикальные меристемы размером до 0.5 мм. Меристемы культивируют на модифицированных средах Мурасиге- Скуга. Для инициации роста побегов из меристем используют цитокинины (чаще всего 6-БАП в концентрации 0.1 -1мг/л). Физические условия культивирования - температура 22-260 С, освещенность 2,5-5 тысяч люкс, влажность 70-75 %. Побеги вишни, сливы, яблони, груши образуются в течение 2,5 месяцев (Высоцкий и др., 1988)

На этапе 2 главной задачей является размножение побегов. Для увеличения эффекта размножения побеги пересаживают на среду, содержащую 1-3 мг/л 6- БАП. Под воздействием повышенных концентраций цитокининов активизируются пробуждение почек в пазухах листьев, закладка и прорастание дополнительных почек. За один пассаж на среде для размножения формируется конгломерат побегов размером от 0,5 до 2,0 см (лучше больше 1 см). Число побегов в конгломерате зависит от особенностей культуры и колеблется от 4 до 20. Коэффициент размножения в процессе нескольких пассажей может возрастать. Оптимальное число пассажей - 5-6. Длительность пассажа - 4-6 недель. Способность к пролиферации в значительной степени зависит от сорта.

На этапе 3 побеги укореняют, для чего концентрацию среды Мурасиге- Скуга уменьшают наполовину, содержание сахарозы - до 20 г/л. Для индукции ризогенеза используют индолилмасляную кислоту в концентрации 0.5-1 мг/л. длительность корнеобразования может составлять 3-6 недель.

На этапе 4 проводится адаптация микрорастений в нестерильных условиях. Пробирочные растения после укоренения высаживают в стерильный субстрат, состоящий из смеси торфа, песка, перлита и почвы, который стерилизуют при температуре 85-90 0С в течение двух часов. Субстрат насыпают в горшочки или ящики, которые устанавливают в теплице. Для адаптации растения в теплице укрывают пленкой в течение 10-14 дней для поддержания высокой влажности. Через 5-8 дней после посадки растения подкармливают раствором Мурасиге-Скуга, разбавленным в 4-8 раз, или раствором Кнопа. После адаптации растения высаживают для создания маточника в теплицу или открытый грунт в начале или середине вегетации.