Гібридомна технологія, схема отримання гібридом.

При потраплянні в організм тварини або людини чужорідного агента – бактерій, вірусів, “чужих” клітин – лімфоцити мобілізуються для знешкодження агента, що був введений. Існує декілька популяцій лімфоцитів, їх функції розрізняються. Продуктом, так званих, Т-лімфоцитів є лімфоцити Т-кіллери (“вбивці”), що безпосередньо атакують чужорідний агент з метою його інактивації. Основна функція В-лімфоцитів полягає в створенні імунних білків (імуноглобулінів), що знешкоджують чужорідний агент шляхом зв’язування з його поверхневими ділянками (антигенними детермінантами), тобто В-лімфоцити вироблюють імунні білки, які є антитілами до чужорідних агентів – антигенів. Однак, розмноження клітин В-лімфоцитів в культурі не дало позитивних результатів в наслідок незначної продуктивності клітин та неможливості їх тривалого існування в поживних середовищах. Цю проблему можна вирішити за рахунок злиття В-лімфоцита з пухлинною клітиною імунної системи – мієломою. Гібридна клітина, що створюється в результаті – гібридома – поєднує в собі здатність тривалого розмноження в культурі, як ракова клітина, із здатністю біосинтезу моноклональних антитіл – моноатів, як лімфоцитарна клітина.

Загальна схема отримання гібридом на основі мієломних клітин і імунних лімфоцитів включає наступні етапи:

1.    Отримання мутантних пухлинних клітин, що гинуть при наступній селекції гібридомних клітин. Відбір таких мутантів пухлинних клітин відбувається за допомогою токсичних речовин. У середовищі, що містить ці речовини, здатні існувати тільки мутантні клітини, які позбавлені можливості синтезувати певні ферменти, що необхідні для запасного шляху біосинтезу нуклеотидів.

2.    Отримання лімфоцитів – продуцентів антитіл до заданих антигенів. Тварину (мишу, пацюка, кроля) імунізують введенням антигену у черевну порожнину, внутрішньовенно або підшкірно. Для отримання гібридом людини використовують імунізацію лімфоцитів людини в культурі тканин, що є більш складною і багатоетапною процедурою. 

3.    Злиття лімфоцитів з пухлинними клітинами. В якості агента, що сприяє злиттю, використовують поліетіленгліколь (ПЕГ), або вірус Сендай, інколи потужне електричне поле.

4.    Скринінг – тотальний відбір гібридомних клітин. Використовують селективне середовище ГАТ (абревіатура речовин, що в ньому містяться – гипоксантін, аміноптерін і тімідін). На цьому середовищі батьківські мієломні клітини гинуть, як генетично дефектні за ферментами запасних шляхів біосинтезу нуклеотидів. Батьки-лімфоцити, що не злилися з мієломними клітинами, також гинуть, оскільки вони не здатні рости поза організмом у заданих умовах. Гібридомні клітини поєднують в собі здатність до необмеженого росту і до синтезу нуклеотидів по запасних шляхах і тому накопичуються у культурі.

5.    Перевірка здатності гібридомних клітин продукувати моноклональні антитіла до заданого антигену. Для цього використовують метод імуносорбентів, при якому, якщо антитіла, що синтезуються гібридомою, дійсно зв’язують заданий антиген, то добавка до них другого антитіла, що зшито з ферментом, викликає створення комплексної сполуки і початок ферментативної реакції із зміною кольору розчину.

6.    Клонування гібридомних клітин, що пройшли перевірку на утворення моноклональних антитіл, з постійним контролюванням на стабільність їх імунних властивостей.

7.    Масове культивування гібридом, виділення, концентрування і очищення синтезованих антитіл.