Анализ ДНКА с помощью гель-электрофореза.

Печень мышей удаляли и гомогенизировали с помощью лизисного буферного раствора (50 мг/мл протеиназы К в 1мМ ЭДТА, 100 мМТрис-HCl с рН 8,0 и 1% додецилсульфат натрия (SDS)). После инкубирования в течение 2 ч при температуре 50 ^оС (или 37 ^оС в течение ночи) собирали лизат ткани, а надосадочную жидкость получали с помощью смеси гидроксибензола/хлороформа/изоамилового спирта (25:24:1). ДНК осаждалась обезвоженным спиртом и натрия ацетатом, затем ее растворяли в ТЕ-буфере (1мМ ЭДТА, 100 мМТрис-HCl с рН 8,0). Электрофорез проводили в 1,5% агаровом геле (содержащем 0,5 мг/мл этидия бромида) в течение 1 ч, а полосы визуализировали и фотографировали в ультрафиолетовом свете.

Двухэтапная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР)

Общую РНК гепатоцитов крыс экстрагировали с помощью реактива TRIzol (Инвитроджен, Пекин, Китай) в соответствии с инструкциями производителя. Последовательность праймеров для крыс выглядит следующим образом: ICAM-1 (прямая): 5' CAGCAGACCACTGTGCTTTGA3', (обратная): 5'GTCGAGCTTCAGGACCCTAGT3'; и b-актин (прямая): 5' ATTGAACACGGCATTGTCAC3', (обратная): 5' CATCGGAACCGATCATTG3'. Последовательность праймеров для мышей выглядит следующим образом: (обратная) 5'CGC- CGGGCTGGGGATGACTTCT3' и (прямая) 5'CACTT- GTGGCCCAGGTATGC3' для bcl-2, и (обратная) 5'GAG- CAGCCGCCCCAGGATG3' [ОБ2] и (прямая) 5'GGTGAGC- GAGGCGGTGAGGAC3' для bax, (обраная) 5'GGGCACA- GTGTGGGTGAC3' и (прямая) 5' CTGGCACCACAC- CTTCTAC3' для b-актина. Двухэтапную ОТ-ПЦР проводили в соответствии с инструкцией к аналитическому набору (Такара, Далянь, Китай) и усиливали с помощью системы GeneAmp PCR (Текне TC512, Великобритания). Образцы РНК сначала обратно транскрибировали, а затем сразу же усиливали с помощью ПЦР. Программу Quantity One (версия 4.40) (производство Байо-Рад, США) использовали для анализа значения оптической плотности полос электрофореза. Чтобы исключить разброс значений по количеству и качеству РНК, данные о мРНК каспазы-3 и ICAM-1 корректировали с учетом экспрессии бета-актина (ОП мРНК каспазы-3 или ICAM-1 в сравнении с ОП мРНК бета-актина).

Иммуногистохимический анализ

Иммуногистохимическое окрашивание для ICAM-1 проводили in situ в 24-ячейковом планшете, покрытом коллагеном с помощью комплекса стрептадивин-биотин-пероксидаза. После удаления среды в различные моменты времени клетки фиксировали в 70% спирте и обрабатывали 0,3% раствором Н2О2-метанола и 3% обычной козьей сывороткой, соответственно. Затем клетки инкубировали в течение всей ночи при температуре 4^оС с анти-крысиным антителом к каспазе-3 и ICAM-1 в разведении 1:500, а затем проводили инкубацию в биотинилированном козьем анти-кроличьем иммуноглобулине, а затем в комплексе стрептавидин-биотин-пероксидаза по 20 минут при температуре 37^оС. 3,3-диаминобензидин-Н2О2 использовали для формирование цвета, а контрастное окрашивание клеток проводили с помощью гематоксилина и визуализировали с помощью инвертированного оптического микроскопа (Никон Имаджинг Сейлс Ко Лтд, Китай). Клетки, окрашенные в коричневый цвет, считались положительным результатом, а зеленый уровень сканировали с помощью программы SimplePCI 6.2 (Ки Бонд Инт. Лтд, Гонконг, Китай).

Статистический анализ

Все данные представлены в виде среднего± стандартная ошибка средней (in vivo) и среднего±СО (in vivo) и анализировали с помощью дисперсионного анализа с использованием критерия Стьюдента (односторонний критерий). Статический анализ проводили с помощью программы SPSS 11.5 (SPSS, Чикаго, США). Различие в Р<0,05 считалось статистически значимым.

РЕЗУЛЬТАТЫ[ОБ3]

Влияние препарата Лаеннек на активность цитозольных ферментов у мышей, получивших Кон А in vivo.

После внутримышечного введения препарата Лаеннек мышам, получившим Кон А, активность цитозольных ферментов печени аланин аминотрансферазы (АЛТ) и ЛДГ в сыворотке крови снизилась на 48,96% и 65,73%, соответственно (Рис.1).

Обозначения

Рисунок 1. Влияние препарата Лаеннек на уровень АЛТ (А) и ЛДГ (В) в сыворотке крови у мышей линии BALB/c

##p<0,01 в сравнении с контрольной группой; *p<0,05, **p<0,01 в сравнении с группой, получившей только Кон А. Каждое значение представляет среднее восьми повторностей; столбцы погрешностей представляют стандартную ошибку среднего.