Исследование потенциала действия Ходжкиным. Микроэлектродный метод. Метод меченых атомов.

Опыты по исследованию потенциала действия (в основном Ходжкиным и его сотрудниками) на аксонах проводились методом микроэлектродов с использованием высокоомных измерителей напряжения, а также методом меченых атомов. Их работа была выполнена на аксоне гигантского кальмара, который представляет собой длинную цилиндрическую трубку, отходящую от нейрона, электрический сигнал распространяется вдоль внешней мембраны трубки. Это нервное волокно достигает толщины 0.5–1 мм (что в сотни раз превышает толщину нервных волокон млекопитающих) и представляет собой очень удобный объект для таких исследований.

Рис.2 Микроэлектродный метод.
1-электрод, относительно которого мы измеряем потенциал действия внутри клетки; 2- клетка (в данном случае гигантский аксон кальмара), в которой мы меряем потенциал; 3-стеклянный микроэлектрод

С помощью микроэлектродов удалось померить потенциал действия внутри аксона кальмара. Микроэлектрод-1 располагается в растворе у наружной поверхности клетки, однако суть микроэлектродного метода заключается в электроде 3 (см. рисунок 2). Это стеклянная игла, сделанная из очищенного кварцевого стекла без примесей, длинною в несколько сантиметров, имеющая кончик  длиною 1 сантиметр и диаметром 1-1,5 мкм. Внутри находится раствор 3,5 моля KCl, в который погружен неполярный электрод из AgCl, что обеспечивает малую поляризацию на границе электрод-раствор. Данный метод достаточно точный, позволяющий измерять величину потенциала до 3его знака в мВ, однако его главным недостатком является медленность измерения, что вносит неточность в измерение потенциала действия. Ходжкин предположил, что при возбуждении резко возрастает проницаемость для натрия, что создаёт Na-ионный ток во время нервного импульса. Величина генерируемого импульса должна зависеть от концентрации натрия снаружи клетки. Тут Ходжкин воспользовался методом меченых атомов. Изотоп натрия - , который позволил проследить только за теми ионами натрия, что движутся из раствора в протоплазму нервного волокна. Для этого в раствор добавляют небольшое количество радиоактивного изотопа натрия. Количество меченых атомов, попавших внутрь мембраны прямо пропорционально радиоактивности протоплазмы, которую выдавливают из аксона. Изотопы не отличаются от обычных атомов ни по химическим свойствам, ни по размеру и проходят через мембрану так же, как и обычные.

В опытах по исследованию потенциала действия использовали два микроэлектрода, введенных в аксон. На первый микроэлектрод подается импульс с амплитудой V от генератора Г прямоугольных импульсов, меняющий мембранный потенциал. Мембранный потенциал измеряется при помощи второго микроэлектрода высокоомным    регистратором напряжения Р. Возбуждающий импульс вызывает смещение мембранного потенциала лишь на короткое время, спустя которое мембранный потенциал быстро пропадает и восстанавливается потенциал покоя.

В том случае, когда возбуждающий импульс смещается еще дальше (смотри рисунок 3) в отрицательную сторону, он сопровождается гиперполяризацией мембраны. Потенциал действия не формируется также и в том случае, когда возбуждающий импульс положительный (деполяризующий), но его амплитуда меньше порогового значения Vпор. Однако, если амплитуда положительного, деполяризующего импульса окажется больше значения Vпор,  становится больше и в мембране развивается процесс, в результате которого происходит резкое повышение мембранного потенциала и мембранный потенциал   даже меняет свой знак – становится положительным ().

Рис. 3 – Исследование потенциала действия: а – схема опыта (Г – генератор импульсов, Р – регистратор напряжения); б – потенциал действия (V – амплитуда прямоугольного импульса, V^пор – пороговое значение амплитуды, t – время,  – мембранный потенциал, φ_вн, φ_нар – потенциалы на внутренней и наружной поверхностях мембраны,  – амплитуда потенциала действия,  – уровень потенциала покоя, – пороговое значение мембранного потенциала, – мембранный потенциал реверсии); в – поляризация, деполяризация и реполяризация мембраны.

Достигнув некоторого положительного значения  – потенциала реверсии, мембранный потенциал возвращается к значению потенциала покоя , совершив затухающее колебание. В нервных волокнах и скелетных мышцах длительность потенциала действия около 1 мс (а в сердечной мышце около 300 мс). После снятия возбуждения еще в течение 1-3 мс в мембране наблюдается некоторые остаточные явления, во время которых мембрана рефрактерна (невозбудима).

Новый деполяризующий потенциал V >  может вызвать образование нового потенциала действия только после полного возвращения мембраны в состояние покоя. Причём амплитуда потенциала действия не зависит от амплитуды деполяризующего потенциала (если только V > ). Если в покое мембрана поляризована (потенциал цитоплазмы отрицателен по отношению к внеклеточной среде), то при возбуждении происходит деполяризация мембраны (потенциал внутри клетки положителен) и после снятия возбуждения происходит реполяризация мембраны.