Метод Циля-Нильсена предназначен для выявления кислотоустойчивых бактерий (возбудителей туберкулеза и лепры).

1. Мазок окрашивают карболовым фуксином Циля (основной краситель) при нагревании 3-5 мин.
2. Обесцвечивают раствором серной кислоты (дифференцирующее вещество) в течение 1-2 мин.
3. Промывают водой.
4. Докрашивают 3-5 мин метиленовым синим (дополнительный краситель).

Клеточная стенка кислотоустойчивых бактерий отличается высоким содержанием липидов. Они с трудом окрашиваются, но затем удерживают основной краситель при обесцвечивании кислотой. Некислотоустойчивые бактерии легко окрашиваются, а затем легко обесцвечиваются кислотой и окрашиваются дополнительным красителем.

 

Метод Ожешко используется для выявления спор. Для этого на нефиксированный мазок наносят 0,5% р-р HСl, подогревают 1-2 минуты над пламенем, промывают водой, фиксируют и далее окрашивают по методу Циля-Нильсена. При этом цитоплазма клетки окрашивается в синий цвет, а споры в красный.

 

Метод Бурри-Гинса используется для окраски капсул бактерий и основан на том, что капсула не воспринимает красители. Капсулу выявляют негативным контрастированием фона по Бури. Для этого черную тушь смешивают в культурой и высушивают. После этого проводят фиксацию в пламени горелки, окрашивают тела микробных клеток по Гинсу - водным фуксином в течение 1 минуты и промывают водой 5-10 секунд. В результате на темном фоне хорошо видна бесцветная капсула и красные тела микробов.

 

Леффлера окраска способ метахроматического выявления волютиновых (РНК + полифосфаты) зерен у коринебактерий и скоплений нуклеиновых соединений у др. бактерий. Для окраски используют щелочной р-р метиленового синего, который наносят на 3 - 5 мин на фиксированный мазок, после чего смывают водой, мазок высушивают и микроскопируют. Протоплазма бактерий окрашивается в голубой цвет, волютиновые зерна - в темно-синий.

 

Нейссера метод окраски используют для выявления зерен волютина у возбудителей дифтерии и др. коринебактерий. Фиксированный мазок 2 - 3 мин красят уксуснокислым синим,10 - 30 с обрабатывают р-ром Люголя, слегка промывают водой и докрашивают в течение 30 с р-ром везувина, высушивают и микроскопируют. Бактерии окрашиваются в желтый цвет, волютин -в темно-синий.

Здродовского метод (холодный Циль-Нильсен) используют для выявления риккетсий внутри пораженных клеток. Для этого: 1. Окрашивают мазок разведенным фуксином Циля (10—15 капель на 10 мл дистиллированной воды) в течение 5 мин.;. 2. Промывают водой; 3.Обрабатывают мазок 0,5% раствором лимонной кислоты или 0,01% раствором НCl; 4. Промывают водой. 5. Окрашивают метиленовым синим в течение 1 мин.; 6. Промывают водой, высушивают препарат. Риккетсии окрашиваются в красный цвет, цитоплазма клеток, в которых они паразитируют,— в голубой, ядра — в синий.

 

 

ЗАНЯТИЕ № 3

ТЕМА: МИКРОСКОПИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ. ЗАЩИТНЫЕ ПРИСПОСОБЛЕНИЯ У МИКРООРГАНИЗМОВ. МЕТОДЫ ИХ ВЫЯВЛЕНИЯ. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОДВИЖНОСТИ. ПОКОЯЩИЕСЯ ФОРМЫ МИКРООРГАНИЗМОВ. МОРФОЛОГИЯ СПИРОХЕТ, АКТИНОМИЦЕТОВ, РИККЕТСИЙ, ХЛАМИДИЙ, L-ФОРМ БАКТЕРИЙ, МИКОПЛАЗМ, ГРИБОВ.

ПЕРЕЧЕНЬ КОНТРОЛЬНЫХ ВОПРОСОВ

1. Споры, стадии и условия образования спор, биологическое значение. Методы выявления спор и кислотоустойчивых бактерий. Техника окраски по Цилю-Нельсену.

2. Капсулы бактерий, их значение. Способы обнаружения. Техника окраски по Бурри-Гинсу.

3. Определение подвижности. Жгутики, их строение. Изучение подвижности бактерий. Методы исследования микроорганизмов в живом состоянии. Темнопольная и фазово-контрастная микроскопия.

4. Формы бактерий с дефектами клеточной стенки (протопласты, сферопласты, L-формы).

5. Микоплазмы. Классификация. Филогенез. Морфология, структура, химический состав, особенности размножения. Методы выявления.

6. Патогенные спирохеты. Систематическое положение и морфология спирохет. Особенности ультраструктуры и химического состава. Методы исследования.

7. Актиномицеты, морфология, ультраструктура, химический состав. Роль актиномицетов в природе и медицине. Патогенные виды.

8. Классификация, морфология и строение грибов и методы их обнаружения.

9. Таксономия патогенных риккетсий. Морфология, структура, размножение, способы выявления.

10. Хламидии, особенности морфологии и структуры. Цикл развития хламидий. Методы выявления.

 

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ И ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА

1►Приготовление мазка из агаровой культуры спороносных бацилл, окраска по методу Ожешко), микроскопия и зарисовка.

Техника окраски спор по Ожешко и кислотоустойчивых бактерий по Цилю-Нильсену (указать, в какие цвета окрашиваются бактерии на каждом этапе окрашивания/ раскрасить таблицу)

 

Этап окраски	Окраска спор по Ожешко
1. На нефиксированный мазок наносят 0,5% р-р HСl, подогревают 1-2 минуты над пламенем, промывают водой, фиксируют и далее красят по Цилю-Нильсену		Окраска кислото-устойчивых бактерий По Цилю-Нильсену
2. Кислотно-термальное протравливание Обработка  карболовым фуксином Циля над пламенем спиртовки (время экспозиции до отхождения паров), снять бумажку, остудить препарат, сполоснуть водой
2. Обесцвечивание Обработка серной кислотой (H 2 SO 4) Концентрация 5%
3. Докрашивание водным раствором метиленового синего (время экспозиции) 3-5 минут

* МТ – Mycobacterium tuberculosis; Str – стрептококк.

 

5►Микроскопия препаратов микроорганизмов, окрашенных по Ожешко и Цилю-Нельсену. Зарисовка препаратов.

 

Bacillus anthracoides Окраска спор по Ожешко Увеличение x 630

Mycobacterium tuberculosis в мокроте Окраска по Цилю-Нельсену. Увеличение x 630

 

 

6►Приготовление мазков из агаровой культуры клебсиелл, окраска по Бурри-Гинсу, микроскопия и зарисовка.

 

Klebsiella pneumoniae Окраска по по Бурри-Гинсу Увеличение x 630

4►Приготовление препарата «раздавленная капля» или «висячая капля» из сенного настоя для изучения подвижности (указать особенности микроскопии препарата)

 

 

Принцип приготовления препарата «висячая капля»: используют специальное стекло с углублением (лункой), каплю исследуемого материала наносят на покровное стекло, края лунки смазывают вазелином Принцип приготовления препарата «раздавленная капля»: используют обычное предметное стекло, наносят исследуемый материал и накрывают («раздавливают») покровным стеклом

Техника микроскопии данных препаратов: г отовый препарат, микроскопируют с иммерсионным обьективом при приспущенном конденсоре (в темном поле)

 

 

5► Приготовление мазков из агаровой культуры дрожжеподобных грибов, окраска водным раствором фуксина, микроскопия.

 

6► Изучение морфологии плесневых грибов.

 

Candida albicans Окраска по Граму Увеличение х 630 Обозначьте на рисунке: 1- дрожжевая клетка; 2- псевдомицелий.

Препарат культуры плесневых грибов Окраска по по Граму Увеличение х 630 Обозначьте на рисунке: 1- конидии (спорангии); 2- стеригмы; 3- конидиеносец (спорангиеносец); 4- мицелий.

 

 

7► Микроскопия и зарисовка риккетсий Провацека в готовых препаратах, окрашенных по Романовскому-Гимзе и Здродовскому.

 

8► Изучение препаратов боррелий в мазках крови, окрашенных по Романовскому-Гимзе.

 

ДЕМОНСТРАЦИИ

Rickettsia prowazekii в органах белых мышей	Rickettsia prowazekii вакцинный штамм	Borrelia recurrrentis в мазке крови
Окраска по Здродовскому х 1000	Окраска по Здродовскому х 1000	Окраска по Романовскому-Гимзе х 1000
Палочковидные микроорганизмы, расположены внутриклеточно	Вакцинный штамм представлен кокковидной формой риккетсий	Боррелии  - тонкие спиральные бактерии, диаметром 0,2-0,5 мкм, длиной 5,0-25 мкм, имеющие 3-10 крупных завитков.Окрашиваются по Романовскому - Гимзе в сине-фиолетовый цвет.

(указать методы окраски микроскопических препаратов и особенности морфологии микроорганизмов – форму и расположение в препарате)

 

ЗАНЯТИЕ № 4