Микроскопический метод диагностики инфекционных заболеваний

Используется как отдельный метод.

Определяет форму, размеры, расположение м/о их структуру, возможность окрашиваться различными красителями. Так же определить наличие спор, капсул, грамм + или -, кислотоустойчивости бактерий, наличие ядра.

6. Методы окраски микробов и их отдельных структур.

Методы окраски.

(Извините, что прерываю, но! Я не знаю куда отнести вопрос про изготовление мазка(препарата), поэтому впишу сюда информацию из тетради, там все понятно и логично)

Чтобы приготовить мазок, на середину чистого обезжиренного (с помощью мыла) предметного стекла наносят исследуемый материал (с помощью бактериальной петли его забирают с пит.среды, делают взвесь в капле физраствора) и равномерно распределяют его на стекле до образования тонкого мазка. Препарат высушивают просто на воздухе и мазком кверху проводят через пламя спиртовки 2-3 раза – зафиксировали! После окраски промывают водой и высушивают, после чего его можно микроскопировать.

(Теперь про окраску)

Отношение микроорганизмов к красителям расценивают как тинкториальные свойства.                                                             Окраску мазка производят простыми или сложными методами.

ПРОСТОЙ МЕТОД ОКРАШИВАНИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПРЕПАРАТОВ (информация из теради)

1. На зафиксированный мазок:

 1.1. При применении растворов красителей нанести водно-спиртовой раствор краски так, чтобы весь мазок был покрыт краской.

1.2. При применении красящих лент поместить ленту на препарат (мазок). сверху намочить ленту водой и прижать к стеклу стеклянной палочкой.

2. Через 1-1,5 мин (экспозиция зависит от вида красителя: для генцианвиолета-1-2 мин, для фуксина -1-1,5 мин, для метиленового синего-3-5 мин) смыть краску водой (краска должна остаться только на мазке) и промокнуть остатки воды фильтровальной бумагой (все стекло должно быть сухим).

3. Микроскопировать с иммерсионной системой (см. правила иммерсионной микроскопии)

 ПРИМЕЧАНИЯ: 1. Окраска мазков производится на мостиках (салазках), расположенных над кюветой.

 2. При применении растворов красителей все краски и реактивы наносятся пипетками. помещенными во флаконы с реактивами. После взятия реактива пипетку поместить в свой флакон.

3. Флаконы с реактивами и красителями из штатива не вынимать,

4. Для высушивания мазков пользоваться нарезанной фильтровальной бумагой (в штативе).

Простые заключаются в окраске препарата одним красителем. При простых методах мазок окрашивают каким-либо одним красителем, они могут быть основные или кислые.                                   

  К Кислым красителям относятся — эритрозин, кислый фуксин, эозин.

Основные красители — генциановый фиолетовый, кристаллический фиолетовый, метиленовый синий, основной фуксин. Преимущественно используют основные или нейтральныекрасители, которые более интенсивно связываются кислыми компонентами клетки. Микроорганизмы окрашивают, наливая водно-спиртовой раствор красителя на поверхность мазка на определенное время. Окраску основным фуксином ведут в течение 2 мин, метиленовым синим — 5—7 мин. Затем мазок промывают водой до тех пор, пока стекающие струи воды не станут бесцветными, высушивают осторожным промоканием фильтровальной бумагой и микроскопируют в иммерсионной системе. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения совершенно прозрачно, а клетки интенсивно окрашены

Сложные методы включают последовательное использование нескольких красителей и имеют дифференциально-диагностическое значение. С помощью них выделяют основные структуры клетки (сча будет мини-табличка, чтобы легче запоминалось, строго не судите)

Структура (свойство) клетки, которая окрашивается	Название метода	Как он делается	Что мы видим в итоге (картинки для наглядности)
Капсула	По Бурри – Гимсу (можно запомнить, типа капсула защищает от бури)	1.Смешиваем каплю взвеси бактерий с капелей туши 2. При помощи стекла делаем мазок,сушим его, фиксируем 3.На мазок наносим водный раствор фуксина (на 1- 2 мин) 4. Промываем водой, сушим, смотрим	Сами бактерии окрасились в красный цвет, а капсулы (обычно состоят из слизи и они не окрашиваются), мы видим четко на черно-розовом фоне.
Клеточная стенка	Метод окраски по Грамму NB! Метод окраски по Граму является важным диагностическим методом. Все бактерии по отношению к окраске по Граму делятся на грамположительные - темно-фиолетового цвета и грамотрицательные - красного. Способность окрашиваться в тот или иной цвет зависит от строения их клеточной стенки и коррелирует со многими другими свойствами бактерий. У грамположительных бактерий в клеточной стенке отсутствуют ароматические и серосодержащие аминокислоты, отмечается низкое содержание липидов, у грамотрицательных, напротив, эти вещества содержатся в большом количестве. Кроме того, у грамположительных бактерий имеется магниевая соль рибонуклеиновой кислоты, отсутствующая у грамотрицательных. Она и образует прочный химический комплекс с белком, генцианвиолетом и йодом, который не разрушается при кратковременном действии спирта. У грамотрицательных такой комплекс не образуется. Они легко обесцвечиваются под действием спирта. Фуксин докрашивает грамотрицательные микроорганизмы в красный цвет.	1. Фиксированный мазок окрашивают раствором генциановиолета в течение 1-2 минут, затем краситель сливают. 2.В течение 1 минуты обрабатывают мазок раствором Люголя. 3.Обесцвечивают спиртом 30-60 сек. 4.Промывают водой. 5.Докрашивают мазок водным раствором фуксина 1-2 минуты, промывают водой, сушат и микроскопируют. ГР+ ФИОЛЕТОВЫЕ ГР- КРАСНЫЕ
Включения (зерна волютина)	По методу Нейссера   Зерна волютина метиленовым синим окрашиваются в черный цвет. При промывке водой тело клетки обесцвечивается и затем в течение 1 мин докрашивается везувином в желто-коричневый цвет. (Чтобы хотя бы это тело было видно)	1.Фиксированный мазок окрашивают ацетатом синьки Нейссера (легко запомнить, типа Нейсер был алкашом) в теч. 2-3 мин 2. Наливают раствор Люголя на 20-30 сек. 3.Промывают водой, окрашивают везувином 1-3 мин. 4.Промывают водой, высушивают.	Тела бактерий окрашиваются в нежный светло-коричневый цвет, зерна волютина - в темно-синий, почти черный цвет.
дифференциации кислотоустойчивых бактерий (возбудителей туберкулеза и лепры) от некислотоустойчивых.	По Цилю –Нильсону Клеточная стенка кислотоустойчивых бактерий отличается высоким содержанием липидов. Они с трудом окрашиваются, но затем удерживают основной краситель при обесцвечивании кислотой. Некислотоустойчивые бактерии легко окрашиваются, а затем легко обесцвечиваются кислотой и окрашиваются дополнительным красителем.	1.Мазок окрашивают карболовым фуксином Циля (основной краситель) при нагревании 3-5 мин. 2.Обесцвечивают раствором серной кислоты (дифференцирующее вещество) в течение 1-2 мин. 3.Промывают водой. 4.Докрашивают 3-5 мин метиленовым синим (дополнительный краситель).	Кислотоустойчивые микроорганизмы окрашиваются в рубиново-красный цвет, некислотоустойчивые - в сине-голубой.
Споры	Метод Ожешко сходен с методом Циля-Нильсена, но отличается использованием раствора соляной кислоты (она разрыхляет оболочку спор и тем самым повышает её окрашиваемость), при этом все окрашивается в красный цвет. А уже потом, когда красим по Цилю -Нильсену при обработке серной кислотой (п.2) вегетативные формы обесцвечиваются и окрашиваются метиленовым синим, а СПОРЫ ОСТАЮТСЯ КРАСНЫМИ	1.На нефиксированный мазок наносим HCl кислоту и подогреваем над спиртовкой 2-3 мин. 2. кислоту сливаем, промываем, сушим, фиксируем и красим по Цилю-Нильсену	Вегетативные формы – синие, споры – красные (см.2 столбик почему)
Вирусы, а также микроструктуры бактерии (в том числе риккетсий, спирохет), жгутиков, аргирофильных и аргентофильных включений и гранул	Серебрение по Морозову. Принцип метода состоит в том, что при обработке аммиачным раствором серебра специфические аргентофильные ингредиенты объекта избирательно окрашиваются в коричневато-чёрный цвет.
УНИВЕРСАЛЬНО	По Романовскому-Гимзе	смесь азура, эозина и метиленового синего	При окрашивании простейших их цитоплазма приобретает голубой цвет, а ядра - красно-фиолетовый.